新しいバイオプロセス計測技術

新しいバイオプロセス計測技術 発酵モニタリングへの最新適用例ご紹介 発酵の主要制御因子を インライン・リアルタイム モニタリング Vaso Vlachos, Mettler-Toledo AutoChem, Inc. バイオ医薬品やバイオ製品の需要 アルタイムに進行するプロセスそ の解説書では、バイオプロセスモ が高まるにつれ、生産性と製品純 のものを反映できないため、プロ ニタリングにReactIRTMとFBRM®を 度を最大限に高める効率的プロセ セス制御の判断は遅れ、バッチ間 利用した4つの事例を用いて、非 ス制御実現のため、高速かつ正 のばらつきが発生してしまいます。 侵襲・非破壊技術のバイオプロセ 確なバイオプロセスモニタリング スへの利用法を示します。 が求められています。バイオリアク ReactIRTMを用いたインライン中赤 ターのインライン測定は従来から、 外分光法では、発酵プロセス進行 ご紹介する各文献の科学的発見に pH・温度・溶存酸素・二酸化炭 中に、増殖培地および代謝産物の ついて詳しく説明するものではあり 素・攪拌速度などが行われていま 複数成分の濃度をリアルタイムに ませんので、それらはオリジナル すが、培地の活性・栄養源・代謝 同時計測できます。一方、集束ビー の文献をご参照ください。ここで 産物などはオフラインで分析する ム反射測定（FBRM®）は、バイオ は装置の利用に関連した、重要な しかありません。これらオフライン マス濃度やモルフォロジーの変化 研究課題の解決手段について詳細 測定には手間と時間がかかり、リ をリアルタイムに追跡できます。こ に解説いたします。

パート Ⅰ：インライン中赤外分光法による栄養源・代謝産物の リアルタイムモニタリング 3 事例 1：中赤外分光法による発酵栄養源と代謝産物の インライン・リアルタイムモニタリング 4 事例 2：単一スペクトルライブラリによる簡易キャリブレーションを用いた 中赤外分光オンライン発酵モニタリング 6 パート Ⅱ：バイオマス濃度とモルフォロジー変化の インラインモニタリング 10 事例 3：集束ビーム反射測定（ FBRM®）による バイオマス濃度変化モニタリング 11 事例 4：ダウンストリームバイオプロセスにおける凝集の インラインモニタリング 14 おわりに 17 付録 A：ReactIRTM測定原理 18 付録 B：FBRM® 測定原理 19 2

パート Ⅰ：インライン中赤外分光 法による栄養源・代謝産物の リアルタイムモニタリング プロセスを効果的に最適化し、製品品質と回収率を最大とするために必要 不可欠なのが、細胞・微生物の栄養源消費および代謝産物の正確な情報 です。それら情報は生産工程においても、プロセス制御パラメーターを効 果的に設定・調整する判断材料として重要です。栄養源と代謝産物濃度の リアルタイムモニタリングは、近赤外、誘電分光法、ラマン分光、二次元 蛍光1,2,3,4で行われた報告があります。しかし中赤外分光法は、それらに勝 る長所を有しています。 1990年代初頭、発酵プロセスのモニタリングにインライン中赤外分光法の 特徴を生かす検討が行われました。提示されたインライン中赤外分光法（イ ンラインIR）の利点は以下のとおりです。3,5,6,7,8 　― プロセス・生化学成分・生物に対し非侵襲で非破壊 　― 高いシグナル対ノイズ比（ SN比） 　― オフライン分析のためのサンプリングと複雑な試料調整が不要。よっ てコンタミネーションの危険性がなく、時間が節約できる 　― プ ロセス内の成分をそのままの状態でリアルタイムに測定するため、 サンプリングによる変化の影響を受けない。 　― 複数の成分（栄養源・代謝産物・生成物）を同時に同定し測定できる ため、バイオリアクターのセンサーを減らすことができ、かつ発酵の 進行状況が即座にわかる 　― 高速な測定で、即座に利用できるデータが得られるので、フィードバッ ク制御への組み込み可能（増殖速度の速い培養ではオフライン分析 での制御が困難なためインラインIRが有利） 　― リアクターの操作条件（攪拌・通気）に影響を受けない 中赤外分光法は発酵モニタリング技術としてこれだけの利点があるにもか かわらず、少数の欠点のために利用が限られていました。すなわち多成分 の増殖培地に対するキャリブレーションが面倒であること、装置のアライメ ントが難しかったこと、その上ソフトウェアが専門家や分光学者でないと使 いこなせなかったことなどが原因です。しかしハードウェアとソフトウェア が大きく進歩し、感度とデータ解析機能が向上することにより、中赤外分 光法は生物学者にも化学者にも容易に利用できる装置となりました。 この解説書のパートⅠでは、ReactIRTMを用いた中赤外分光法で、重要なプ ロセスパラメータを測定し、発酵プロセスの進行をモニタリングした適用 事例を2つご紹介します。ひとつめの事例は、ReactIRTMで発酵プロセス中 の栄養源消費量と代謝産物生成をリアルタイムにモニタリングすることに 成功した初期の研究です。次に、莫大なキャリブレーション段階を簡素化し、 重要なプロセス成分の濃度を正確に予測した新しいReactIRTM活用法につい て解説します。 3

事例 1： 中赤外分光法による発酵中栄養源と代謝産物濃度の インライン・リアルタイムモニタリング In Situ Monitoring of an Escherichia coli Fermentation Using a Diamond Composition ATR Probe and Mid-Infrared Spectroscopy, Denise L. Doak and Janice A. Phillips, Department of Chemical Engineering, Lehigh University, Bethlehem, Pennsylvania, USA, Biotechnology Progress, 1999, 15, 529-39 ドークら（1999）5は、大腸菌のバッチ発酵において、ごく初期のReactIRTM モデル（K4コンジットおよびDiCompプローブ装着のReactIRTM1000）が、 追記 時間経過に対して優れた安定性を有していることを証明しました。SN比± 未発表の研究で、著者らは、未知成分は酵母エキスとリン酸塩との反応によって 0.00033AUであり、撹拌・通気・システム停止に影響されませんでした。 形成されたリン酸化糖であると同定して います。 反応器内での培養液（グルコースを除く）の滅菌サイクル中、ReactIRTM でリアルタイム測定を行った簡単な実験で、リン酸化合物（1000～ 900cm-1）と炭水化物（1250～ 950cm-1）の明確な特性吸収を伴う波数 範囲1250～ 850cm-1に、有意な変化が観察されました（図1.1）。また、 ReactIRは予期していなかった成分 が生成していることを検出し、それ が滅菌サイクルの完了時にも培地に Carbohydrates 1250-950µm 残存していたことを確認しました。 Phosphorylated 研究では次に、ReactIRTMが発酵中 Compounds 0.60 の成分濃度の変化をモニターし、 1000-900µm 0.50 定量化できるか、特に滅菌サイクル 0.40 中に形成された未知物質の動静を 0.30 Absorbance 見極められるかを検討しました。グ 0.20 ルコース250g/Lを滅菌培地に無菌 0.10 的に添加し、発酵pHは7.0で制御、 0.00 温度は30℃としました。グルコース 2000 -0.10 消費、酢酸の形成と滅菌中に形成 1800 150 された未知成分をReactIRTMでモニ 1600 120 ターしました。 1400 90 Time (min) 1200 Wavenumber 60 1000 30 800 0 図 1.1　滅菌サイクル中（30℃ 121℃へ昇温後40分 ホールドし、30℃まで冷却）のReactIRTMデータ。 10分毎にスペクトル採取 3b. hydrated form of carbamazepine 4

発酵中に得られたスペクトルデー タを図1.2に示しました。有機酸は 0.20 蓄積する一方、グルコースおよび 未知成分が消費されていることが 0.16 わかります。図1.3は、それら3成 分の時間変化を示したものであり、 0.12 最初にグルコースが消費され、時 Absorbance 0.08 間を置いて未知成分がグルコース と共に消費されていることがわか 0.04 ります。グルコースが消費されるに 0.00 つれ酢酸が蓄積されていますが、 10 グルコースが枯渇すると酢酸が消 8 費されます。未知成分は、発酵11 2000 6 1800 時間後にも残存しています。 1600 4 Time (hr) 1400 2 1200 1000 0 まとめ Wavenumber 800 これは発酵プロセスモニタリングに インライン ReactIRTMが適用可能 図 1.2　発酵中のReactIRTMスペクトル であることを示した初期の研究で す。ReactIRTMを使用した簡単な実 験で、他の手法では検知されたこ とのなかった、滅菌サイクルにお ける増殖培地の変性を発見しまし Unknown た。培地中の重要な成分をモニタ Glucose リングすることで、微生物発酵プ Acetic Acid 30 100 OD@650nm ロセス全体の代謝経路が判明し、 発酵終点の検出も可能でした。ま 25 た、長時間の発酵プロセス、さら 80 に長期間の複数のバッチにわたっ 20 ても、ReactIRTM測定は安定である 60 ことが確認されました。 15 40 10 20 5 0 0 0 2 4 6 8 10 12 Time (hr) 図 1.3　発酵プロセス中のグルコース・未知成分 （殺菌中に生成）・酢酸の相対濃度変化 5 Relative Concentration Absolute Concentration (g/L) or OD

事例 2： 単一スペクトルライブラリによる簡易キャリブレーションを用いた 中赤外分光オンライン発酵モニタリング 注記：この研究において、吸光度は直線的に増 加することを前提としており、ランベル Online Monitoring of Nine Different Batch Cultures of E. coli by Mid-Infrared ト・ベールの法則に従っています（付録A Spectroscopy, Using a Single Spectra Library for Calibration ReactIRTM測定法をご参照ください）。 Jonas Schenka, Carla Viscasillasa, Ian W. Marisonb, Urs von Stockara a. Laboratory of Chemical and Biochemical Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne （EPFL（, CH-1015 Lausanne, Switzerland b. School of Biotechnology, Dublin City University, Glasnevin, Dublin 9, Ireland Journal of Biotechnology 134 （2008（ 93–102. シェンクら（2008）8は、バイオプロセスモニタリング で中赤外および多変量モデルを使用するために、いか Acetate 1st Drift Spectra に大規模かつ複雑なキャリブレーションが必要かを報 Ammonium 2nd Drift Spectra 0.4 告しました。キャリブレーションには、増殖培地中の Glucose Glycerol 測定すべき成分のすべての濃度範囲にわたって、多数 0.3 の標準液の調製と測定が必要です。この作業は長時間 を要すると同時に、新しい培地や条件が探索される開 0.2 発作業には不向きです。もし中赤外分光法のキャリブ レーションがもっと簡単であれば、複数の栄養源と代 0.1 謝産物濃度の同時測定が実現できるのですから、標 準的なバイオプロセス測定法と相補的になるはずです。 0.0 著者らは、必要な標準液の数が6分の1となる、単一ス -0.1 ペクトルライブラリを活用し、異なる培地組成におい 1500 1400 1300 1200 1100 1000 て、主要な代謝産物の濃度を正確に予測することがで Wavenumber (cm-1) きるかを検討しました。 図 2.1　使用した6スペクトル。波長範囲1000～ 研究論文の内容は非常に広範でしたが、この解説書の 1500cm-1内で計算。ドリフトした2スペクトルは、 明確化のためファクター 4で強調した 主旨に照らし、異なる培地組成に対するスペクトルライ ブラリの信頼性に関する報告と、ペプトンや酵母など の添加物を含む化学的に未解析で複雑な培地に対す る堅牢性に関してのみ解説します。 120 Glucose 100 Ammonium 実験方法 Acetate80 検体には、学界・産業界で広範囲に使用されている大 60 腸菌を選択しました。濃度測定を要する成分は、グル 40 コース・グリセロール・アンモニウムイオン・酢酸であ 20 り、酵素分析キット（R-Biopharm、ドイツ）で測定し ました。すべての中赤外スペクトルはDiCompセンサー 0 を搭載したReactIRTM分光計によりATR法で採取され、 -20 0 100 200 300 400 500 濃度は従来の最小二乗回帰を適用して計算しました。 Time (min) 図 2.2 a　グルコースによる大腸菌バッチ増殖中 の、グルコース・アンモニウム・酢酸の濃度変化。 酵素分析によるオフライン値（点）とFTIRによる オンライン値（線） 6 Concentration (mM) Absorbance

結果と考察 単一スペクトルライブラリに含めた 160 Glycerol 成分は、グルコース・グリセロール・ 140 Ammonium アンモニウム・酢酸です。信号強度 Acetate 120 がドリフトする問題は、因子分析で 100 2本の「ドリフトスペクトル」を抽出 し、それをライブラリに含めること 80 で除去し、代謝産物濃度の測定と 60 信号ドリフトの補正を同時に行うこ 40 とに成功しました。ライブラリで使 20 用した6スペクトルを図2.1に示しま 0 した。 -20 0 100 200 300 400 500 このライブラリ法の効果と信頼性を Time (min) 検証するため、異なる炭素源、す なわちグルコース、グリセロール、 図2.2b　グリセロールによる大腸菌培養中のグリ グルコースとグリセロール混合にお セロール・アンモニウム・酢酸の濃度変化。酵素 分析によるオフライン値（点）とFTIRによるオンラ ける大腸菌培養に適用しました。グ イン値（線） ルコースとグリセロールそれぞれの 培養での、炭素源・アンモニウム・ 酢酸の測定値は、オフライン分析 値とよく一致しました（図2.2aおよ 130 Glycerol び ）。また、これら培養は炭 Ammonium2.2b 110 Acetate 素源で制限され、窒素源の消費量 90 Glucose は60％であったと確認できました。 70 予測値の標準偏差（SEP：Standard Errors of Prediction）はグルコース、 50 グリセロールがそれぞれ3.2mMお 30 よび8.7mM、アンモニウムと酢酸 10 が8mMでした。 -10 グルコースとグリセロールを同 -30 0 100 200 300 400 500 じモル濃度混合添加した培地の Time (min) ReactIRTM測定値は、グルコースが 最初に消費され、その後、グリセ ロールが急速に消費されたことを示 図2.2c　グルコース・グリセロール混合による大腸菌培養中のグルコース・グリセロール・アンモニウ しています（図2.2c）。ReactIRTMで ム・酢酸の濃度変化。酵素分析によるオフライン 測定した濃度変化は、グルコースが 値（点）とFTIRによるオンライン値（線） 消費されている段階ではオフライン 測定値とよく一致しましたが、その 後、大きく逸脱しました。著者らは、 2つの炭素源の構造と官能基が類似 しているためと説明しました。著者 らは、このライブラリによるモデリ ングは、単一の炭素源であれば正 確であるし、似た官能基を持つ2つ 以上の培養基質がある培地におい ては、定性的に正確であると結論 づけました。 7 Concentration (mM) Concentration (mM)

スペクトルライブラリの堅牢さを検 証するため、酵母エキス・ペプトン・ 120 Acetate グルコースを含む、化学的に未解析 Glucose な富栄養培地での大腸菌培養に適 100 用しました。ReactIRTMによる濃度 80 測定値は、オフラインデータと良好 に一致しました。SEP値は、グルコー 60 ス6.1mM、酢酸3.4mMでした。こ 40 れにより未知成分が添加された増 殖培地にも適用できる十分な堅牢 20 性があると結論づけられました（図 0 2.3）。 -20 0 100 200 300 400 まとめ Time (min) 大腸菌バッチ培養のオンラインモ ニタリングにおいて、6スペクトルで キャリブレーションした単一ライブ 図2.3　富栄養培地での大腸菌培養中のグルコー ス・酢酸の濃度変化。酵素分析によるオフライ ラリを用いた最小二乗回帰モデリン ン値（点）とFTIRによるオンライン値（線） グは、従来のケモメトリクス法と同 程度の正確さと予測能力を発揮し ました。特にキャリブレーション時 間の短縮という大きなメリットがあ ります。また、主成分回帰法（PCR） を用いませんので、プロセスモデリ ング専門家でなくとも容易に利用で きます。さらに主要な培地成分およ び代謝産物の濃度をモニタリングす ることで、微生物培養の代謝経路 を即座に把握することができます。 ウェビナーのご案内 酵素的エステル化の反応予測 酵素による脂肪酸エステル生産工程へのインラインFTIR分析計 の導入についてアンドレアス・リーゼ博士が解説します。高粘性・ 無溶剤で、ノボザイム435を触媒として使用した新しいプロセス を開発し、パイロットスケールでの試験を行いました。 FTIRを用 いた操作パラメーターの最適化とプロセス制御のための分析法 について議論します。 クリックして無料オンラインセミナーを見る 8 Concentration (mM)

パート I のまとめ インライン中赤外分光法による栄養源・代謝産物の リアルタイムモニタリング 2つの実例で報告されたデータや議論により、インラインReactIRTM中赤外 分光法は、バイオプロセスモニタリングにおいて、他の技術に比べ高い優 要旨： 位性があることを示しました。初期のReactIRTMシステムに関する研究では、 － ReactIR TMは培地成分の濃度変化を正確・ 確実・リアルタイムに追跡します。 発酵プロセスの複数のバッチに渡り、システムの完全停止も含め、長期間 の安定性が実証されました。実際の現場で使用する要件を満たしていると － プロセスパラメータのリアルタイムモニタ 言えます。 リングにより、発酵プロセスの理解が深まるとともに、迅速なプロセス制御が可 能となります。 確実に言えるのは、In Situ ReactIRTM中赤外分光法の最大の利点は、同時 かつ正確に、栄養源の供給と消費および代謝産物の生成と消費をモニタリ ングできるということです。定性的・定量的データを得ることで、バイオリ アクター内そのままのリアルタイムな発酵進行状況がわかり、プロセス因 子の理解が深まります。ReactIRTMのリアルタイムデータを用いたプロセス 制御により、プロセス変動を即座に検出し、バッチ間の再現性を維持し、 高い製品品質と回収率を実現できます。 単一スペクトルライブラリ法により、バイオプロセスのプロセス開発段階に おいても、ReactIRTMが利用可能となりました。ソフトウェアの進歩で、分 光法やモデリングの専門家ではない生物学者や化学者でも、ReactIRTMが 容易に利用できるのです。 光ファイバコンジットを備えた新プローブの開発により、自動光軸合わせが 可能となるとともに、設置が容易になりました。新しいファイバープローブ は、蒸気滅菌だけでなく、バイオリアクター内でのオートクレーブ滅菌にも 対応が可能です。またマルチプローブ対応で、複数のバイオプロセスをそ れぞれ同時モニタリングできるようになりました。これらハードウェアの進 歩により、バイオプロセスモニタリングにおけるReactIRTMの利便性は大幅 に向上しています。 ReactIRTM設置例 2本のファイバープローブ（光軸自動調整可能） を装着したReactIRTM 詳しくはwww.mt.com/ReactIRをご覧下さい 9

パート II：バイオマス濃度と モルフォロジー変化の インラインモニタリング バイオマス濃度（菌体濃度）は培養の増殖段階を知るための指標です。バ イオ製品・細胞株・微生物株・発酵の需要は増加しており、より良い生産 性を得るためのバイオマス濃度の最大化をめざして、プロセス制御パラメー ターの最適化が行われています。高密度培養では、培養物の高代謝に対 応するため継続的なモニタリングを必要とします。濁度計、インライン分 光計、蛍光を用いた装置、ARDプローブ9、静電容量4,10などのインラインモ ニタリング技術が試みられていますが、いくつもの欠点があります。最近、 集束ビーム反射測定（FBRM®）で発酵のバイオマス濃度の変化がモニタリ ングできるという報告がなされ9,11、さらに糸状菌および植物細胞のモル フォロジー変化と、細胞の凝集が検出できることが確認されました。モル フォロジー変化や細胞凝集の発生を検知できれば、バッチ発酵の生産性 を向上できます。 プローブ型のインライン装置であるFBRM®は、プロセスまたは培養に対し 非侵襲・連続的に、微生物や細胞の数・大きさ・モルフォロジー変化をリ アルタイム測定します。ここではFBRM®による糸状菌培養と大腸菌の高密 度培養のモニタリングついて解説します。次にFBRM®により凝集をモニタリ ングし、発酵のダウンストリームである脱水を検討した例をご紹介します。 10

事例 3：集束ビーム反射測定（FBRM®） によるバイオマス濃度変化 モニタリング Use of Focussed Beam Reflectance Measurement （FBRM®（ for Monitoring Changes in Biomass Concentration Jessica Whelana, Eilis Murphyb, Alan Pearsonc, Paul Jeffersd, Patricia Kierana, Susan McDonnella and Brian Glennona a. UCD School of Chemical and Bioprocess Engineering, UCD, Belfield, Dublin 4, Ireland b. Training Department, National Institute of Bioprocessing Research and Training, Foster’s Avenue, Mount Merrion, Blackrock, Dublin 4, Ireland c. Pharmaceutical Operations, MSD Ireland, Clonmel, Tipperary, Ireland d. Process Analytical Sciences Group, Pfizer Ireland Pharmaceuticals, Loughbeg, Cork, Ireland Bioprocess and Biosystems Engineering 2012, Online DOI 10.1007/s00449-012-0681-9 ウィーランら（2012）9はFBRM®のバイオマス濃度変化に対する感度につい て報告しました。著者らは、植物細胞・細菌・ハイブリドーマ細胞株に関 し検討を行っています。この解説書では特に、大腸菌の高密度培養、糸 状菌、およびストレプトマイセス・ナタレンシス（S.natalensis）に関して得 られた知見についてご紹介します。 実験方法 S.natalensis：振盪フラスコおよび攪拌槽型バイオリアクターで培養し、24 時間ごとにサンプリング、乾燥菌体重量（DCW）を測定しました。 FBRM® によるオンライン測定は20Lバイオリアクター内で行いました。 大腸菌：高密度大腸菌は振盪フラスコと20Lバイオリアクターで培養し、1 時間ごとにサンプリングしました。DCWは、予め秤量したエッペンドルフ 装置の特長 チューブに培養液1.5mL（×2サンプル）を入れベンチトップ型遠心分離機 で14,000rpm、20分間遠心分離し、脱イオン水で洗浄、遠心分離、50℃ FBRM G400とオートクレー で乾燥、これを重量一定になるまで繰り返して決定しました。 ブ用プローブを用いることで、リアルタイムにバイオマ スの変化をインラインモニタ FBRM®：FBRM®を用いて細胞のカウント数とコード長を測定しました。 リング FBRM®プローブは20Lパイロットリアクターの攪拌が良好な位置に挿入し、 オンライン測定を行いました。 詳しくはwww.mt.com/FBRMG400をご覧下さい 結果と考察 バイオマス濃度の変化が示されました。FBRM®はバイオリアクター内の微 生物をそのままの状態で測定し、コードの長分布として変化の速度と変化 量を追跡します。FBRM®は、粒子の大きさ・形状・粒子数の変化を高感度 に測定します。（ 付録B　FBRM®測定法をご参照ください）。 11

600 A B C D E S.natalensis 500 FBRM®でバイオマス濃度およびS. natalensis糸状体 の大きさの変化を測定可能か確認するため、試料を 150、180、212、250、300μmメッシュのふるいでフィ 400 ルタリングしました。回収したフラクションを再懸濁し、 FBRM®によってモニタリングしながら順次混合しまし た。図3.1は、FBRM®が細胞数の増加と平均コード長 300 の増加を、ともに追跡できていることを示しています。 次にバイオマス濃度（乾燥菌体重量g/L DCW）と 20075 FBRM®のカウント数の相関性を検討しました。攪拌槽 型バイオリアクターからサンプリングした2バッチ（DA-1 70 とDA-2）の結果を図3.2に示しました。FBRM®のカウン ト数と最大4g/L DCWまでのバイオマス濃度との間に高 い相関がありました。さらなる高濃度では、FBRM®カウ 65 ント数は非直線的になりました。これは高い細胞濃度 において検出領域内の粒子数が過剰となり、すべての 60 粒子を各々測定できなくなったためで、予測どおりです （付録B　FBRM®測定法をご参照ください）。データは示 55 しませんが20Lバイオリアクターを用いて行われたオン ラインFBRM®測定でも同様の結果が得られました。 50 大腸菌 図3.1　菌体の添加（ A:180μm、B：212μm、C： 大腸菌のバイオマス濃度の変化に対しても、 250μm、D：300μm、E：>300μm）にともな S.natalensisと同様、FBRM®の感度を検討しました。 うFBRM®の総カウント数と平均コード長の増加 大腸菌を振盪フラスコで一晩培養し、10、25、50お よび75％（v/v）に希釈し、FBRM®カウント数および DCWを測定しました。 FBRM®カウント数とDCWは、 6,000 直線的に相関していました（図3.3）。次に、20Lパイロッ トスケールのバイオリアクターで培養したプロセス中濃 5,000 度を代表するサンプルを用いて、FBRM®カウント数と バイオマス濃度の相関性を検討しました（図3.4）。デー 4,000 タは、3つの領域に分かれています。第1の領域はバッ チ培養段階（0～ 4.3g/L DCW）であり、FBRM®カウン 3,000 ト数とバイオマス濃度に高い直線的な相関があります。 DA-1 第2の領域は、流加培養段階（4.3～ 4.5g/L DCW）で 2,000 DA-2 DA-1 Concentrated あり、傾きは減少したものの、やはりFBRM®数とバイ DA-2 Concentrated オマス濃度との間に高い相関があります。最後に、発 1,000 酵終点付近（>45g/L DCW）では、FBRM®カウントは 増加しませんでした。 S. natalensisの項で説明したよ 0 0 2 4 6 8 10 12 うに、高いバイオマス濃度で予測されていたことです。 Biomass (g DCW L-1) 図3.2　オフライン試験DA-1とDA-2および、 各濃縮サンプルにおける平均総カウント数 （unweighted, 1～1000μm）とバイオマス濃度 との関係 12 Total Counts (s-1) Mean Chord Length (µm) Total Counts (s-1)

30,000 30,000 A. R2 = 0.98 B. R2 = 0.98 y = 18062x + 253.8 y = 18423x + 140.8 25,000 25,000 20,000 20,000 15,000 15,000 10,000 10,000 5,000 5,000 0 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 Biomass (g DCW L-1) Biomass (g DCW L-1) 図3.3　大腸菌の一晩培養液AとBの希釈液によ るFBRM®総カウント数とバイオマス濃度との関係 著者らは、FBRM®は大腸菌の高密度培養において、 45g/L DCWまでのバイオマス濃度の変化を高感度に 測定できると結論付けました。培養では最終的に50g/ 80,000 L DCW程度の濃度に達することはありますが、最も重 要な指数増殖期をモニターできますので、加流速度を 70,000 適正にし、副生成物抑制のために増殖速度を一定値 以下に制御することができます。 FBRM®で大腸菌の指 60,000 数増殖期をモニタリングすれば、リアルタイムに増殖 速度の情報が得られ、バイオマス濃度が臨界値に達す 50,000 2 るようにプロセスを制御することが可能となります。 R = 0.97 40,000 y = 669.67x + 44819 まとめ 30,000 この広範囲な研究により、FBRM®は、糸状菌・S. natalensis・大腸菌高密度培養のプロセス内における 2 20,000 R = 0.97 バイオマス濃度の変化を高感度に測定できることを確 y = 8869.1x + 8855 認しました。FBRM®をインラインで使用し、リアルタ 10,000 イムにバイオマス濃度の変化をモニタリングすれば、 バイオマスの増殖段階が即座にわかるとともに、プロ 0 セス制御能力が上がり、バッチ間のばらつきの低減と 0 10 20 30 40 50 60 製品収率の向上が実現できます。 Biomass (g DCW L-1) 図3.4　パイロットスケール大腸菌発酵のFBRM® 総カウント数とバイオマス濃度との関係 13 Total counts (s-1) Total counts (s-1) Total counts (s-1)

事例 4：ダウンストリームバイオプロセスに おける凝集のインラインモニタリング Marine Microalgae Flocculation and Focused Beam Reflectance Measurement Nyomi Uduman, Ying Qi, Michael K. Danquah, Andrew F.A. Hoadley Department of Chemical Engineering, Monash University, Wellington Road, Clayton, Victoria 3800, Australia Chemical Engineering Journal 162 （2010（ 935–940 発酵プロセスのダウンストリーム清澄化は、ろ過材を大量に使って何度も 処理を行うため、困難な作業であり長時間を要します。一方、凝集は、コ ストとエネルギーが低いという利点から、多くの産業で一般的に使用され ている脱水方法です。バイオプロセスで懸濁した細胞と細胞微粒子を分離 するために凝集を利用すれば、清澄化にかかる時間と資材を減らし、結 果としてコストを削減し、同時にプロセスの堅牢性と生産性を向上するこ とができます。12,13,14 このオーストラリアの研究グループ の事例では、バイオディーゼル生産 Addition of 4mg/L 71303 における海洋微細藻類培養の様々 なダウンストリームプロセス用凝集 剤の検討が行われています。海洋 <10µm 微細藻類は、バイオディーゼル生 900 10-50µm 産において淡水微細藻類より優れ、 800 150-300µm 実用化に近づいていますが、培養 700 液が希薄で細胞が小さいため、脱 水のダウンストリームプロセスが煩 600 雑かつ高価となります。現状の遠 500 心分離およびろ過では、エネルギー 消費が高く、コストが高いため、生 400 分解性があり低コストで環境に優し 300 いバイオディーゼルの利点が減って しまいます。著者らは、集束ビーム 200 反射測定（FBRM®）を使用して凝 100 集過程を測定し、リアルタイムにプ 0 ロセス速度を観測、プロセス終点 0 200 400 600 800 およびフロック強度を求めました。 Relative Time (s) 実験方法 図4.1　カチオン性ポリマー71303（4mg/L）に 凝集実験には、半連続培養リアクターによる混合海洋微細藻類の培養液 よる海洋微細藻類の凝集を、FBRM®のコード長 （主にChlorococcum sp）を使用しました。複数のカチオン性およびアニ 範囲で3分割したカウント数の変化で追跡 オン性ポリマーの凝集能力をスクリーニングしました。 FBRM®により凝集 中のコード長の変化（付録B　FBRM®測定法をご参照ください）を測定し ました。 14 Counts/sec

結果と考察 凝集工程の効率は、ポリマーの分子量、微細藻類細胞とポリマーが衝突 する確率だけでなく、粒子同士がどれほど付着しやすいかに依存します。 インラインFBRM®で凝集過程をモニタリングすると、凝集剤を添加した後、 ただちに微小粒子のカウント数（<10μmと10μm・50μm）が減少し、粗 粒子のカウント数（150～ 300μm）が増加します（図4.1）。このデータに より、凝集剤が細胞を凝集させていること、すなわち微小粒子のカウント 数減少と粗粒子のカウント数増加によって示されるフロックの形成が確認 できます。 550秒後には大きなフロックが崩れて小さな粒子の数が増える という、破砕現象と見られる変動があります。このようなリアルタイム情報 はダウンストリームプロセスを理解し、制御するために重要です。 まとめ 凝集は様々な産業で利用されており、所望の生成物を細胞や細胞残屑か ら分離するダウンストリームプロセスとして、多くのバイオプロセスに利用 可能な優れた脱水方法です。 FBRM®の測定値は、凝集速度を知り、フロック強度とフロック安定性を理 解し、凝集終点を決定する上で不可欠です。pHや温度などのパラメーター にこの情報を加えれば、フロックの大きさと強度、そして凝集プロセスの 効率を向上できます。 ウェビナーのご案内 インライン粒子測定技術を用いた 固体凝集の迅速な最適化と制御 凝集プロセスを最適化し制御するためのIn Situプロセス分析技術の 応用について解説いたします。次のような実験室およびプラントで の最適化と制御の実例をご紹介します。 「細胞・細胞残屑の分離」「紙～パルプの収率・歩留まり・製品品 質」「油／砂の尾鉱の沈降速度」「鉱業における廃水の沈降速度」「凝 集剤と界面活性剤の効果」 クリックして無料オンラインセミナーを見る 15

パートⅡのまとめ バイオマス濃度およびモルフォロジーの変化を インラインでモニタリング FBRM®は、大腸菌・糸状菌・S. natalensisのバイオマス濃度の変化を高感 度に測定できます。インラインでのバイオマス濃度変化測定により、バイ 要旨： オマスのリアルタイムな状態を知ることができるとともに、プロセスの迅 － FBRM®により、バイオマス濃度とモル 速な調整やプロセス終点の検出が可能となります。結果として生産性を向 フォロジーの変化をリアルタイムに追 跡することができます 上し、歩留まりを高めることができます。 － FBRM®でリアルタイムに凝集の進行 ダウンストリームプロセスにおける所望の生成物からの固形分分離法とし 速度・終点・最適なポリマー添加量およびフロック強度を決定すれば、清 ての凝集は、技術の有効性だけでなく、低コストであることからも関心を 澄化の速度を向上させ、ろ過面積と 集めています。FBRM®を用いて凝集の進行速度・終点・最適なポリマー量・ 時間を削減できます フロック強度をリアルタイムに求められますので、清澄化の速度を向上さ － FBRM®プローブは定置蒸気滅菌、オー せるとともに、ろ過にかかる面積と時間の削減につながります。 トクレーブに対応しています すべてのFBRM®プローブは、一般的に大規模なバイオプロセスで行われる 定置蒸気滅菌（Steam-in-Place）が可能です。FBRM®のGシリーズは新機 能として、着脱式オートクレーブ対応プローブを備えていますので、発酵や 他のバイオプロセスにおけるプロセス開発研究でもFBRM®の効率的な使用 が可能となりました。 ウェビナーのご案内 発酵プロセスにおける細胞の 数・大きさ・形状のインラインモニタリング このウェビナーでは、学会・産業界での発酵プロセス（大腸菌・ 哺乳動物細胞・植物細胞・糸状菌を含む）における実例を解説し ます。アプリケーション例には以下がございます。「サンプリング 不要で細胞数とサイズをモニタリング」「インライン測定値とオフ ライン測定値の相関性」「細胞およびフロックサイズに対するせ ん断の影響」「細胞の大きさと形状の変化メカニズムを検討」「振 盪フラスコからパイロットスケールへの効率的なスケールアップ」 クリックして無料オンラインセミナーを見る 16

おわりに バイオプロセスで所望の生成物の生産性を最大とするには、プロセスを効 果的にモニタリングし制御する、プロセス分析技術（PAT）の必要性が明 らかです。インライン中赤外分光法ReactIRTMとFBRM®はいずれも、プロセ ス開発研究と生産現場において、バイオプロセスのリアルタイムモニタリン グと制御に活用できます。 ReactIRTMは、栄養源や代謝産物濃度の正確な複数同時モニタリング、 FBRM®はバイオマス濃度の変化を追跡できます。これらの重要な測定項 目を標準的なバイオリアクター用センサーと組み合わせれば、発酵の進行 状況監視に不可欠な情報となり、プロセスの逸脱を即座に検出することが でき、効果的なプロセス制御を実現します。 ReactIRTMとFBRM®には、サンプリングが不要になること、プロセスや培養 液に対し非破壊、非侵襲的であることという利点があるとともに、これら の装置からのリアルタイム情報が、迅速なプロセスの理解と適切なプロセ ス制御を可能とします。効率的なプロセス制御がバッチ間のばらつきを減 少させ、所望の生成物の純度と回収率を最大限に高めます。 その他の参考資料 ホワイトペーパー ウェブサイト バイオ技術へのPAT利用法 バイオプロセスと発酵に関 するホームページには、ア Track the criti p cr ao l c pe as rs a f mro em te rin s o incu tl ha et feWith Mid ion r mto e nfi tn a- a tI iR l o, n mu yield p lr tio pc le es s a. n R ae lya tl e- sti m cae n m bo en ti rt ao cked in re In a itial patProces–s suc Analyritngi ac hll a wh a yas ows l Te l timhe throuology fo rthe tra th e b iod met ae sm nsition from c s l tion g ho of uc tr i ati c f etha ge et r nabo ag to al min ent ol rl o wthites, or the d ee xponentia fl o g r am tio fici a ne ti o an cetate n cy of ke ry o wn tu ht , t h we it ha out delay bioma プリケーション情報と製品ri sen s(PAT) f ts. ccumulation PathwIn oan exr B of inhibiting ay for pra om dup cl tie of iotech on of EPS e t t ha el . a ( d2 v0 a0 n f c re ud c a to4) use pd p s li i e n ca s ti it ou n R o g f luconace A Review of Recaeppnliteldy a nR aeported Appelia P t d cc r t oIR ce an aptiv ™ ss Analytical e c ation FsT IiRn t oF seimrmentation aTencdhn BoloiogyP, Krocessing Fo iguba ntro ultan orn r m e 1-5.t Mch e- tt ao b- ob la st tc ra eousl annh glu lic sta tv ea gr y y m con tes i a to maximiz oe nbility. y i i te ol rd so ix ace for f t ah nal t y aa nl produc b ti io omass ae n dd e tes, and , 2004) ns .i (r re ed f: p Kr oo rd nu mc at nn et Mea as nu dr e rm ede un ct es of k fr eu yc nto us tre i, e a nm tsm anon d i mum etathe , a b n old i tp eh sd o – s p eth ha ae nsi ored te – l w , a cp er er to ad teu , w c i tt h – c gl e monitored o n us ce oc nu ace along t wiv ie tan. The pro th x f y ed-batch fe c r em sl sinu e n wt as, s i dn e sw igh nic ations of eh d e the bacter G ia l t uh ca onol, fed a t wa a nacetobacter 情報以外に、ホワイトペー c s firs ac oe nt ta r tt o l cl ued lt ir va atee in the te b dt on a feed oi oo maintain a f w ri et ah c ti on rc . r Ee ta h s a co in ng o nsta l b fi eo e n m d t li en vc er le oa f a sevoidi an sg s, e mth aa x d i m exponenol ii zn inh gib Op btioi ntiam llya ssi gzration of Fermentation limitin ig ti ow ofa n. Once dis ts hctor, a o while e ft ra un c tp or se fe anldved e od x w Byigas oenu o Pbercaomcessing duction sed to m e . a Terry P. Raxeidmmizaen g, lUurcso nGarco-th, Fabio Visentin, Dominique Hebrault, The ability Ben Smith, Des O’Grady, Brian O’Sullivan, METTLER TOLEDO to mea si sm uru el tt han e e co ou ns cl ey n, u trs ai tn ig o nin o s fi mt ultiple key a Fermentation ofa nprdo vbidioinprgocessing play ua M a id “meta naly -sIiRs ,o hf aosp n tbi aecael den ly n te d s esscity (OD) and con- nologies (PAT) framework and Quality bo rib critical roles Tinr athcke idn l eigsc ic o thv sniesr a ym aentda manu- cen ptsrhaotito”n[ oSf imvauklteispale analyt de si n( vtiear mHPsL C by Design (QbD) initiative of the US FDA ba bt ol va facture of new pchha rpmroavcieduetsi caanls and s icp ef-ingearnpdr inott hienr rmethods) ha est haell,p e 2al tim ed 0 0u1n]d. er- and other global regulatory agencies. In パーやウェビナーをご用意 t h insight and ea tcialty chemicaalts ,c aanndn oint btehe sustainable st arnodu taen tdo ibmioprove th he roopuegrahtoiount tohf eb io- situ measurement of critical process pa- rea p production of bulk fuels and cliozmedm wodit-h r oo cfrfelainct ess o eo rssa, but there can b pe tsiimmp gn izifaictaionnt cost rameters enables more accurate determi-le a ity chemicaTlhs.e Y feat sfte ramentation processes and time delay ninavloylsviesd. in withdrawing, nation of process kinetics and dynamics nd are often op seni sn itger raetead with a mini imvea lr el lesvpeoln sep oref pMaring, and analyzing samples on an to create more detailed understanding, -tim id-I of monitocrhinagra and con et rmolo, nliimtoirting othf em ulotnipgoing ba Rs iiss. Icna fpeadb-blea tochf pferromviedn-tation, more accurate models, and the capabil-cter le a Figure 1 ability toI nop stimize y iizealdtiso ann da npdro duction nalytes -6. Reaitu el um co idn a t which often rel ifeoio srn o mn the controlled con- ity of real-time control. Advanced Process o ore efficient ing l-time da ito f t h two conse ta collected rates. ring of c centratioen f eorf ma esnpetacitfic limiting nutrient, Analytical Technologies can also be ap-G. c x uy tli ive fed-b dur real ritical pro ion proces n - -t uime o cess va s. s on e atch cultur p t et h si a m n of i ozation a rin ad c time-delays b lceasn w rielslu altl sion significant de- plied to achieve greater understanding f eed was lu as ne dd ft ro u cg te osema on en . a Onc nera Ete thanol However, fexrimmeinzteadti oynie t lpdr oacnedsses involve rovli oatfi fe e ionrsm freonmt optimal operatio bnl.e and optimization of fermentation and oxygen up nta ia tit a redu io l n b pro feed ke be io ca mm ac sed ces wa e s s l .s im e sw it living cells that can be extremely sensitiveb atch-to-bat sc h fo v ra riabil bioprocesses. p ir to cd hu edc e t ing it o g l fu ruc co t o fay. s c e t oto r, con to slight changes in their environment. Within the pharmaceutical industry, pro n d au cc et. tan (E tinue t( or e C f: o K P o Sr )n am sa tn hn e desired As a result, many bioprocesses exhibit a process analytical measurement of criti- pyright Els eev t i ae lr ., , u 2s 0e 0d 4 b , y F ip ge . r 3m , しています。 significant amount of natural batch-to- cal process parameters is one of the key ission) batch variability. Offline sampling and elements of the Process Analytical Tech- 4 3b. hydrated form of carbamezapine クリックしてダウンロードする www.mt.com/ac-fermentation ホワイトペーパー ウェビナー ウェビナー 酵素触媒の新技術 発酵プロセスにおける細胞数・ 固体凝集の迅速な最適化と制御 粒径・形状モニタリング Recent conAfirming the pcaused d v rolonged e eg xr pa od ancesa uti res of th e iprnod c oo nn ocl fu td he ed l t a u h ca to c t n t e t othe r i tn hg e cm atalyst and p a. Organic Che reacmtio o hn ie o s t shis y, re phat 0.28after the acet oa ute ld bet stropy sulting in p ero bd uu fc fep t rl o 0.25 conversio en d i a ss. p s t approxima The authors 0.23roduct to ma cx om telyim pi lete, and fo 9ll -o 1z 0e w hours, i 0m .20m 00:41:53in is y eo ield. In dl by the ediately 0.18 04:28:53 A Review of Recentlayt inRge A d l oc io n dow poh g n rotle 2d a tA 9p5%p lyiicat itohins,s th eU asuteld ihnogrs rIenp oSrtietdu th Sa p streecamtr oisoslcatoi py 0.15 1o 7:4n 3:5 . o 3 t ft h the e 0.13 p roces C s 0.10 o sun cc cl eu eds eio d 0.0n 80.05 In situ React 0I .0R 3™ b 0i .0o 0c pa rt oa vl iy dt eic d r te ha ec ti ao un t hm oe rc s h with the 1 90i 0n 1were also a 80 n 0i 1 ab s 7 m 00 to pre fove rmn ation to un ble . 1600 1500 1400 13t 0o 0 a 1200 11 c mh oie nv ito t r the the unde derstand 00the 40 Wavenumbe 1r 0 ( 00reaction sired co ir c m m -1 900 800 e an optimi z p p ) 70 r 0e ogress a 5.9 ( nte d eting reactio 39r 5t d- b pu rt oy cl ed di ure o fo pr t it mh ie z em te dep h n .8 th r e . r Tyl ote ea hey 5 a k s .7 i e lyloxy)-6-o c x t c io tion condit 38 pH 0.24 y i o 5 0l . T .actonized o s tt e n t r oa fh ayd cr eo ty- l2 H m ns to 6 r 22 at - oiety i 37 5.5 FTIR 0.20 (hyd in side chai py r ro ax ny - n 2 - (y (l) 2m S,4R)-m 4- 5 0.4 .18 eth 0y .16l n) precursor (4 ethy m -tei tl rahydro-2 R H ,- 6 l S ) acetate to p 36 5.3r 0.14d conditions pp yr r - a 4n -- (2 t- eo rtn -e b. uty o l vd ide 5.2 0.12 oved The i e mn et 35 5.1 0.10 to be high yie zl y h d m yl in a s g t ilyloxy)-6- 05 .08 ia c n cd atalysis em 34 0.06The N eco 4.9 enoxmitca lSl teps ipnloye d under 0.0y 4 favo 00r :0a 0ble 03. :00 0 06 .: 00 20 09:00 12: 00 .0 00 R 1e 5la :0t 0ive T 18:00 -0.02Enzymatic Catalysis ime (hour 2s 1) :00Figure 1.3. Vaso Vlachos, Mettler-Toledo AutoChem, Inc. Enzymes, as biocatalysts, are a highly dation, reduction, addition – elimina- This white paper highlights three exam- suitable, environmentally friendly alter- tion, halogenation and dehalogenation, ples – pharmaceutical, academic and native to heavy metal industrial cata- and transesterification(1,3). ReactIR™ is military – where ReactIR™ was used lysts. The “Green Chemistry” nature a real-time in situ reaction analysis sys- to monitor the enzyme-catalyzed reac- of enzymes as catalysts is based on a tem that enables scientists to easily and tions in real time, to enable researchers number of characteristics. Enzymes are rapidly obtain comprehensive informa- to understand reaction mechanisms, and biodegradable and typically prTodeucehd notiloon ganyd understanding about reaction determine kinetic parameters. It is not through fermentation of renewable feed- chemistryS. RpeaocttIlRi™gh mtonitors reactive the intent to go into detailed scientific stocks(1) or easily mass produced through chemistry using well understood mid- findings as these were documented in recombinant technologies(2). Enzymes IR spectroscopy. A robust ATR probe is each paper and it is recommended to also catalyze chemical reactions under inserted directly into the reaction ves- read the original publications for this mild temperature (20°C-40˚C) and pH sel, providing a “molecular video” of the Spuyrnpotshe.e Inssitesa dW, the author highlights conditions (pH 5-8), and perform well reaction. The concentration changes of D the context in which o RreakcstIRta™t iwoasn ussed eliveri in aqueous environments(1). Examples all key reactive and transient species are and hng pan ow rtohdd u b cio is htesl pfoerd e raerslye aarchers answer -pha ppli of enzyme-catalyzed industrial-scale monitored allowing for mechanism and ti r m mkee pyr qesuestion as.ceutica ca l ti in od nu ts et ss tu inr go e in th p st to de ri l eiv se r c an b e e fc inh ea l and speorganic reactions include hydrolysis, oxi- pathway determination. imized. Sci pe roducts u ls ei nging. c C iah le tyand n c t to is h i t e n s m c a i n cd al,reas e n n gg si yntheti m c ir so tn s a e pers eo ers are utes re th n a t h ua nder e c themistry l ple ra o required to h ave not ye d ds u cto ti vs ith yo . r C m t h bter a a r ka ec t te he rig ee hd te d n e v S e c y lo rizing isp im onnthe e s s n th t eti m pre os c a ess f aw sh teis wo nd il r e E oa ps ty iMax® pl ra kt sfo tarm tio lower cos m ns such as ts i . zing for c ph roduct a En ad s ®allenges of y p Mro ax and Oto pd ca es tiM y’ s as x c d ™o em ve , pp lop re oti mtiv ee nt, ena v b il din eg a simO pptiM ga lx o™ bal mar k sc le et. ientists to meet the www.mt. Tc o 6 om lea/s ry nn mth oe rs ei s v- isw ito rkstations クリックしてダウンロードする クリックしてダウンロードする クリックしてダウンロードする 17 Tr (°C) LabMa Rx eT ah ce tir om no Ss pta et c_ tC ra/l n [1 A. U(p .]H) 1223cm-1 [A.U.]

付録 A： ReactIRTM測定原理 ReactIRTMの主要な特長は、様々な条件下でIn Situ測定が可能であるこ と、容易かつ迅速に化学反応全体の情報と解析結果が得られる高機能で 直感的操作が可能な反応解析ソフトウェアを有していることです。 www.mt.com/ReactIR ランベルト・ベールの法則 ： A=abc aとbは定数であるからA（吸光 度）は濃度に比例する 検出器へ戻るIR 入射するIR a：吸光係数 b：光路長（cm） c：モル濃度（mol/L） ZnSe保持部 ハステロイ外壁 IR ダイアモンド 浸透距離 センサー部/ATR結晶 （DP）=2μm サンプルへ浸み出した エバネッセント波 6回反射 ReactIRTMのコンセプト ReactIRTMは、フーリエ変換赤外分 理解を高められるよう、FTIR分光 光法（FTIR）の原理に基づいた分光 データを解析するための強力で汎 器です。しかし、化学者やエンジニ 用的な統合装置として設計されて アは、スペクトルだけでなく、反応 います。化学反応モニターにはあま に関する情報に興味があります。し り使われない従来のFTIR分光計や H たがってReactIRTMおよびiC IR反応 Nそのソフトウェアとは対照的な存在 解析ソフトウェアは、分光専門家で です。 N N CONH-tBu H なくともシステムのパワーを完全に N CONH-tBu 活用し、化学反応・生化学反応の Intermediate 0.14 0.12 300 0.10 H H N N N 0.08 H2 H2 2000.06 N CONH-tBu N CONH-tBu N CONH-tBu H H 0.04 100 0.02 0.00 0 1700 1650 1600 Time (mins) Wavenumber (cm-1) 18 Concentration

付録 B： 収束ビーム反射測定（FBRM®） 最適化のためのリアルタイム測定法　－　FBRM®は非常に高精度、高感度 な技術であり、粒度分布、粒子形状、粒子数の変化を追跡します。検出範囲 は0.5～2000μmと広く、粒子の形成挙動をリアルタイムに測定できるため、 プロセスの制御と最適化に用いられています。また、高濃度なサンプル（70 ％やそれ以上）や、不透明な懸濁状態でも、サンプリングやサンプル調整が 不要です。 図c　コード長分布 レーザー光源 レーザー光もどり 光学系 1 2 3 4 図b 図a 図d　統計値のトレンドグラフ サファイアウィンドウ FBRM®の原理 FBRM®プローブを溶液や流動する 毎に数千のコード長が個々に測定 高濃度スラリー・液滴・エマルショ され、コード長分布（Chord Length ン、または流動層に直接差し込み Distribution：CLD）が形成されま ます。接液部であるサファイアウィ す（図c）。CLDは粒子全体の指紋で ンドウの表面にレーザーが収束され あり、そこから得られる統計値を用 ます（図a）。拡大図にレーザー光 い、粒子のサイズや個数の変化を が粒子の集合体で後方散乱され、 リアルタイムでモニタリングするこ プローブに戻る仕組みを示しまし とができます（図d）。 た（図b）。後方散乱光のパルスはプ ローブで捕捉され、コード長に変換 従来の粒子分析技術とは異なり、 されます。コード長とはスキャン速 FBRM®は粒子の形状を仮定しませ 度（レーザー光の移動速度）とパ ん。よってこの原理による測定値は、 ルス幅（時間）を掛けたものです。 粒子のサイズ・形状・個数の変化を 一つのコード長（測定された粒子 直接表す測定値として利用できま のサイズ）とは粒子や粒子集合体 す。 の、ある一端から一端までの直線 距離と定義されています。通常1秒 19

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