【技術資料】CO2蓄積をインラインで制御(溶存CO2電極)

INGOLD Leading Process Analytics CO2蓄積をインラインで制御 細胞培養プロセスが向上 細胞培養において溶存CO2レ ベルを測定し管理することの 重要性と価値が再認識されて います。しかし、アットラインや オフラインのCO2測定では、プ ロセス向上に不可欠なリアル タイムのモニタリングができま せん。インラインセンサを用い てバイオリアクター内で直接お こなう連続測定は、生産性と最 終製品の品質の両方において 大幅な改善をもたらします。 はじめに るバイオリアクターではその脱離が制限され、培養上 あらゆる形態の好気性生物はCO2を必要とします。人 清内での蓄積の原因となります。CO2濃度が高すぎる 体におけるその濃度は5%であり、動物細胞をex vivo と（110～150 mmHg）、細胞増殖だけでなく、生産性 で増殖させるときには最低濃度としてこのレベルを維 や、例えば対象物の目的とするタンパク質のグリコシ 持する必要があります。 ル化に対して実質的な悪影響があります。 ex vivo培養モデル（例：バイオリアクター）内では、いく 培養収率の向上 つかの理由によりCO2の測定とモニタリングが不可欠 過去十年間において、細胞培養プロセスの生産性 であると考えられています。CO2は一般的に細胞の代 はベンチトップから生産までのあらゆるスケールで 謝、不安定なpH制御、および培地の緩衝液処理により 2～3 g/lまで増えました。パーフュージョンを用いた連 生成します。不要なCO2蓄積は、浮遊性または接着性 続的な流加培養モードにおけるこうした進歩は、生産 培養モデルを用いるすべてのバイオリアクターにお スケールのバイオリアクターのサイズ低減、培地の進 いて問題となる可能性があります。低～中細胞密度で 歩、および細胞株の最適化などのプロセス理解を含 稼働する低容量バイオリアクターではCO2が気液界面 む、多くの要素を調整した結果です。しかしながら、こ で除去されますが、容量が大きく高細胞密度で稼働す うした生産性の向上は、バイオリアクター内における White Paper

dCO2を測定する理由 代謝インジケータ CO2レベルは、具体的な生産性と具体的な増殖率を引き上げる原因となる代謝フラックスに強い影響を 与えます。 CO2はプロセス最適化（例：供給、誘導、温度シフト）の戦略をデザインするのに使用されます。 CO2生成率。 プロセスの中には、pHと共にインラインCO2がインライン乳酸推定のためのモデル開発に使用され、より リアルタイムの分析を提供するものがあります。 pH制御 細胞外および細胞内pHに強い影響を与え、いずれも生産性と製品品質に関わりがあります。 CO2濃度は、重炭酸塩緩衝液で処理された被験液の緩衝液システムに強い影響を与え、pH安定性を脅か します。 重量オスモル濃度 溶存CO2濃度は細胞外および細胞内のモル浸透圧濃度に強い影響を与えます。 製品品質 CO2濃度は直接的または間接的にグリコシル化パターンと分子安定性に強い影響を与えることがあり ます。 細胞内pHが強く 非付加価値細胞代謝プロセス。 影響するもの 重要な代謝およびタンパク質生産機能にかかわる酵素の活動。 重要な機能の反応速度 PTMされたタンパク質の品質と安定性 (Schmelzer & Miller, 2002)。 細胞の周期、転写、寿命、遺伝的安定性。 表1： バイオプロセスでdCO2を制御する理由 乳酸や溶存CO2 (dCO2) のような不要な副生成物の プロセスと使用される組換え細胞株によって違うため 蓄積量の増加など、副次的な問題を伴ってきました。 です。 高/低dCO2レベルの問題 可能性は低いですが、クレブス回路におけるCO2の自 バイオリアクターにおける高dCO2濃度は、細胞培養に 然細胞生産により、低dCO2レベル（5 %未満）は細胞 明らかな悪影響（ 不要な代謝変動、増殖阻害、それに に対する機械的ストレスの原因となり、また、プロセス 伴う生産性低下）をおよぼします。さらには、特に動物 生産性に強い悪影響をおよぼします。そのため、dCO2 細胞株を用いた発現モデルでは、組み換えタンパク質 は培養中は常に要求された範囲内に維持することが のグリコシル化パターンも変えてしまいます。非常に 不可欠です。低dCO2の値は、CO2スパージングによっ 高いレベル (200～250 mmHg) では、dCO2が動物 て、または補助供給を通じて上昇します。 細胞に対して細胞毒性をもち、迅速に是正されない場 合はバッチの生産性の損失につながります。 溶存CO2の制御方法 dCO2および/または乳酸の高蓄積は、通常、アルカリ 以下の式で示されるように、上述の効果がすべて 炭酸溶液を添加してpHレベルを望ましい範囲に下げ dCO2による細胞内 (pHi) および細胞外pHの低下に ることで制御されます。細胞培養は、アルカリ添加が よって引き起こされるということは、これまで十分研究 最小限であるときに安定しているとして適しており、こ されており、広く報告されています1–4。 れは被験液中のdCO2レベルが低いことを間接的に示 しています。そのため、精密で信 C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O 6 H2CO3 6 H+ + 6 HCO3– 頼性の高いdCO2測定は、安定し たバッチ生産性の実現と蓄積の C6H12O6 2CH3CHOHCOOH 2CH3CHOHCOO– + 2 H+ 予防において重要です。 式1および2： dCO2 がどのように細胞内・細胞外pHを低下させるか dCO2の蓄積は、重炭酸塩の濃度 dCO2濃度の最適な操作範囲は、CHO細胞培養を例と と重炭酸塩の培地への添加、細胞代謝で生成された して、一般的に5～30 %であると言われています。範 CO2、不十分なCO2除去（ストリッピング）、およびpH制 囲がこのように広い理由は、理想的な範囲が具体的な 御のためのその添加を含む、これら要素の組合せに 依存しています。 2 METTLER TOLEDO White Paper In-line Control of CO2 Accumulation

CO2ストリッピングは、液体から気相への適切な物質 dCO2がインラインの大型バイオリアクターで測定さ 移動を確実にする、適当な空気またはN2の体積流量 れない場合は、酸素制御（空気またはO2が分離して を供給することで制御されます。CO2蓄積は、バイオ DOの設定値を維持）を用いて間接的にCO2をストリッ リアクターの撹拌速度よりも、気体の体積流量と気体 ピングするため、最低限のCO2除去効率しか達成でき の滞留時間の影響をより強く受けると言われてきまし ません。これでは、不安定なCO2蓄積により、バッチ間 た5。N2ガス流量の増加はCO2をストリッピングするた で増殖率と生産性に差が生じます。 め、pHの変動を減らし、潜在的にアルカリ添加の全体 の還元につながります。つまり、アルカリの還元量は、 酸素要求量（O2設定値）に合わせてエアスパージング 乳酸レベルが通常どおり減少したときにバッチの最 と共にdCO2が測定・制御されるとき、CO2の蓄積量は 後で低分圧CO2 (pCO2) をもたらします。培地成分、バ 低下し、最適な生理学的範囲（40～50 mmHg）で維持 イオリアクター操作戦略（例：消泡剤の添加）などの他 することができます。さまざまな制御戦略を細胞株、バ のパラメータも、ストリッピングの効率に影響します。 イオリアクターのサイズ、スパージングの方法および 高細胞密度を達成するためのプロセスのタイ CO2濃度を上昇 CO2濃度を低下 プに基づいて展開することができます。 細胞からの排出 細胞による消費 （例：好気性代謝産物） （例：独立栄養生物） CO2ストリッピング効率はスケール、バイオリ CO2のスパージまたは 空気、O2、N2のスパージまたは アクターH/D率、およびスパージャー設計に依 オーバーレイ オーバーレイ（ストリッピング） 存しているため、バイオリアクター間で決して 添加物 添加物（例：CO2スカベンジャー） 同一にならないことを理解する必要がありま 表2： dCO2を上昇・低下させる一般的な方法 す。そのため、CO2ストリッピングのための戦 略は、それぞれのプロセスモード、バイオリア クター寸法、および細胞株にとって独自のも dCO2ストリッピングの成功戦略は、溶存酸素 (DO) の のであるべきです。 制御戦略と組み合わせることができます。モノクロー ナル抗体生産用の大規模バイオリアクターでうまく 血液ガス分析装置、ならびにその他のオフラインお 実施されてきたDOおよびdCO2制御戦略には複数の よびアットライン手法における問題 組合せがあります。これには、CO2と酸素のため別の 通常、血液ガス分析装置 (BGA) のような機器を用い スパージャー要素の使用、多孔管と焼結スパージャー たオフライン測定は、低サンプリング頻度（通常、日に （またはフリット）の組合せ、インペラ混合ゾーン内の 1または2サンプル）の制約を受け、アットラインまた 複数のスパージャー要素の配置が含まれます。 はオンラインモニタリングには使用できません。さら に、被験液からのサンプリングは、サンプルの特徴を ベンチトップ型バイオリアクターでは、CO2は通常、 変化させる可能性があるという問題を潜在的に抱え オーバーレイ回路構成（バイオリアクターの上部空 ています。サンプル採取から測定までの温度変化と時 間）を空気や窒素などの中性ガスと用いることにより、 間の遅れは、すべてdCO2レベルに影響します。こうし まずストリッピングされます。空気 / O2が焼結スパー た問題はBGAに限ったものではありません。どのよう ジャーを通じて供給される場合、pH制御のためのCO2 なオフラインまたはアットライン手法であっても、本 注入にも同一のスパージャーを使用します。別の焼結 来のレベルからdCO2濃度が変化してしまう影響を受 スパージャーがCO2添加に適しており、空気 / O2用ス ける可能性があります。 パージャーが酸素制御だけでなくCO2ストリッピング にも使用できると、理想的です。 インライン測定の利点 インラインdCO2センサを使用すると、オフライン/アッ 大型のバイオリアクターでは液体の比表面積が減少 トライン分析における問題がなく、精度の高いリア するため、dCO2除去のための他の戦略においては、 ルタイムの測定ができます。インラインセンサからの 気体注入のためにバイオリアクターの底部を用いる データは、バイオリアクターの寸法（高さ / 奥行の割 設計をする必要があります。前述のとおり、過剰なスト 合）、スパージャーのデザイン、ストリッピングに使用 リッピングとdCO の蓄積はいずれも細胞増殖に有害 される気体の種類、または細胞株に関係なく、CO 添2 2 であり、最適な範囲は、細胞株、バイオリアクター比お 加または除去を明らかにするのに使用されます。厳格 よび目的とする最終製品によって異なります。 にdCO2制御を行うと、細胞増力率を最大30 %、動物 White Paper METTLER TOLEDO 3

メソッド 短所 オフライングラブ 高いサンプリングエラー率： ガス放出、ハンドリング サンプル サンプルの動的特性： 温度変化、細胞からの生成または消費 補正に関する信頼性： サンプルは、稼働中のプロセス外のオフライン分析装置に用いられます。この測定は、 バイオリアクター条件に補正されなければなりません。多くの分析装置では、媒質の性質に基づいた補正曲 線の入力ができません（例：血液ガス分析装置は媒質ではなく血液に基づいて温度を補正します）。 排ガス分析 液相内の非直接測定： 排ガス分析は気相のCO2を測定します。こうした方法は、KLaや溶解度のような溶液の 動的特性により、溶けている中身の変化を説明することはできないため、バイオプロセスでは不十分です。 高価 (例: 質量分析装置のコスト) 複雑、面倒なメンテナンス 表2：グラブサンプルおよび排ガス溶存CO2測定における短所 および昆虫細胞では特定の生産率を30 %超上げる 可能性があることが報告されています6。 pH 参考値 CO2電解液 前述した長所以上に、連続インラインモニタリングの 隔膜 最も重要な長所は、dCO2濃度を定められた限度内に 制御し、限度を超過したときにアラームを発生させる 比較電解液 ことができる点です。 HCO– + H+ ほぼ平らなpH感受性ガラス3 ナイロンメッシュ (スペーサー) メトラー・トレドのソリューション シリコン製膜、スチールメッシュ補強 セバリングハウス原理に基づいた溶存CO 測定は非 PTFE薄膜2 測定対象 CO 常に一般的であり、以前は特にBGAなどのオフライン 2 分析装置でバイオ医薬品業界の基準とされてきまし た。この原理をインラインセンシングに適用しようと する試みは実現してきませんでしたが、ガラスpH電極 図1： InPro 5000 iの主要な内部部品 の設計と構造におけるメトラー・トレドの能力により、 こうした制約はなくなりました。結果として、ベンチトッ します。緩衝液システム内のpH値は、下式で示すとお プから製造スケールまでのバイオプロセスのための り、被験液に存在する溶存CO2の分圧と直接的に関係 インラインCO2センサだけが、市場で販売されてい があります。 ます。 k1 k2 CO2 (aq) + H20 H2CO3 H+ + HCO3– dCO2センサ InPro 5000 iの設計は、BGAに使用するも 炭酸 重炭酸塩 のと同じ電位差滴定二酸化炭素セバリングハウス電 極をベースにしており、微生物が体験するものとちょ 式3：水中におけるCO2の化学反応 うど同じ溶存CO2濃度を測定します。サンプリングエ ラーが排除され、生物系のエネルギーに影響する溶 式3の平衡定数をヘンリーの法則 (CCO2 = a·pCO2) と 存CO2濃度の代謝変動は測定値に反映されます。 組み合わせると、pHは式4に示すようにPCO2の関数が 成りたちます。 コンパクトなInPro 5000 iは、特許取得済みのCO2選 択透過膜（図1）により、バイオリアクター被験液から分 KCO KH (pCO )pH = – log 2 2 ける重炭酸塩緩衝液システムを活用しています。被験 (HCO3– ) 液からのdCO2は、緩衝液と平衡状態になるまで膜を 式4：pHとCO2分圧の関係 通って拡散されます。CO2分圧の変化は、内蔵pH電極 によって測定される、電解液内のpH値に変化をもたら 4 METTLER TOLEDO White Paper In-line Control of CO2 Accumulation

式4のKCO2およびKHの2つの定数は、I nP ro ています。ベンチトップから製造のラージスケールま 5000 iで使用されるCO2と緩衝液（CO2電解液） で、溶存CO2を測定、管理することは細胞培養プロセ に特異的です。 スへの理解を深めます。インライン溶存CO2測定は、 効果的な制御戦略の実現を可能にする、リアルタイム InPro 5000 iは衛生的に設計されており、滅菌サ で連続的なデータを提供し、プロセス収率と最終製品 イクルとCIP洗浄作業に耐えることに適していま の品質の向上につなげます。InPro 5000 iインライン す。pHは温度依存性であるため、内蔵温度セン CO2センサは、正確な溶存CO2測定を提供するように サは、連続して正確な温度補正を実現するため 作られており、すべてのバイオプロセス要件に合致し に用いられます。 ます。 センサの測定精度（読取値の± 1～2 %）、信頼 www.mt.com/inpro5000i 性、応答時間は、pHの変動や代謝物質（グルコー ス、グルタミン、グルタミン酸、乳酸、アンモニウム 1 Ogorzalek, T. and Gramer, M.「A semi-empirical mathematical model useful for describing the relationship between carbon dioxide, など）の濃度に影響されません。 pH, lactate and base in a bicarbonate-buffered cell-culture process （重炭酸塩緩衝液処理の細胞培養プロセスにおける二酸化炭素， およびメトラー・トレドの変換器は、 pH，乳酸および塩基の関係性を示すのに有益な半経験的数学モデInPro 5000 i ル）」『Biotechnol. Appl. Biochem（. 生命工学および応用生化学）』 dCO2を測定するだけでなく、変換器のPID機能で (2007) 47, 197 – 204 制御できるシステムを構成しています。 2 Kimura, R.; Miller, W.「Effects of Elevated pCO2 and / or Osmolality on the Growth and Recombinant tPA Production of CHO Cells（. CHO 細胞の増殖と組換え型tPA生産に関する上昇pCO2および/またはモル 高度なセンサ診断機能 浸透圧濃度の作用）」『Biotechnol. Bioeng（. 生命工学および生体工 InPro 5000 iは、メトラー・トレドのインテリジェ 学）』(1996), 52, 152 – 160. ントセンサマネジメント(ISM®)デジタル技術を 3 deZengotita, V.; Kimura, R.; Miller, W. 「Ef fects of CO2 And Osmolali t y on Hybridoma Cells: Growth, Metabolism and 装備しています。ISMはアナログ電極では不可能 Monoclonal Antibody Production（. ハイブリドーマ細胞におけるCO2 だった多くの特徴を備えています。こうした特徴 およびモル浸透圧濃度の作用：増殖，代謝およびモノクローナル抗 には、長すぎる配線でも安定しており、周辺機器 体生成）」『Cytotechnology（国際細胞検査士）』(1998), 28, 213 – 227. からの干渉に影響されないセンサと変換器の 4 Taticek, R.; Petersen, S.; Konstantinov, K.; Naveh, D.「Effect of 間の堅牢なデジタル信号が含まれます。優れた Dissolved Carbon Dioxide and Bicarbonate on Mammalian Cell 予測診断は、いつセンサメンテナンスを実施す Metabolism and Recombinant Protein Productivity in High-Density Perfusion Culture（. 高密度パーフュージョン培養での哺乳動物細胞の る必要があるかを算出し、 故障したセンサがバ 代謝および組換えタンパク質の生産性における溶存二酸化炭素および イオリアクターに据え付けられることを防止しま 重炭酸塩の作用）」1998年カリフォルニア州サンディエゴ細胞培養VI で発表 す。ISMセンサは自身の校正データを保持し、プ 5 M ostafa, S. and Gu, X.;「Strategies for Improved dCO2 Removal in ロセスから離れた便利な場所で校正することが Large-Scale Fed-Batch Cultures（. ラージスケール・フェドバッチ培養 できます。 におけるdCO2除去向上の戦略）」『Biotechnol. Prog（. 生命工学の進 歩）』(2003), 19, 45 – 51 6 Matanguihan R. et al.「Solution to the high Dissolved CO2 Problem まとめ in High-Density Perfusion Culture of Mammalian Cells（. 哺乳動物細 pHと溶存酸素に加えて、溶存炭酸ガスも細胞培 胞の高密度パーフュージョン培養における高溶存CO2問題のソリュー 養における重要なパラメーターとして認識され ション）」掲載書籍：Lindner-Olsson E., Chatzissavidou N., Lüllau E. (eds)『Animal Cell Technology: From Target to Market（. 動物細胞技 術：ターゲットからマーケットへ）』ESACT Proceedings, (2001), vol 1. Springer, Dordrecht. METTLER TOLEDO Group www.mt.com/pro Process Analytics 詳細はウェブサイトをご覧ください Im Hackacker 15 CH-8902 Urdorf お問い合わせ先： www.mt.com/pro-MOs InPro および ISM はメトラー・トレド グループの商標です。 予告なく製品仕様を変更することがあります。 © 11 / 2017 METTLER TOLEDO. All rights reserved. Rev A / eVersion only MarCom Urdorf, CH