NanoFCM　フローナノアナライザー

NEW 従来のナノ粒子計測技術であるTEM ナノ粒子の定量化が困難でした。 NanoFCM は検出器に SPCM (Single でサイズ、蛍光検出でフェノタイプ 最小40nm からの生物由来粒子の測 各種疾患の早期診断に関連する EVの NanoFCM フローナノアナライザーは電子顕微鏡に匹敵する解像度とフローサイトメーターの高いスループットを兼ね備えた装置です。 ウイルスやナノ医薬品、細胞外小胞（EV）などの単一ナノ粒子の高速解析を可能にし、これまでに世界各国から 400 件以上の論文が公開されています。 従来のフローサイトメーターではマイクロスケールの測定が主流であり、単一ナノ粒子（100nm 以下）の定量的測定と生物学的特性解析を一つの装置 で行うことはできず、複数の装置や方法を組み合わせる必要があり、試料の前準備や測定に時間がかかる問題がありました。 NanoFCM の登場により、簡便で迅速なナノ粒子の測定方法が実現され、研究者の間で大きな期待を集めています。 NanoFCM はフローサイトメトリーの技術を応用してナノスケールでの特性評価を可能にする技術で、Xiaomei Yan 教授によって開発されました。彼 女は Los Alamos 研究所の National Flow Cytometry Resource (NFCR) でフローサイトメトリーの研究を行い、「SheathFlow における単一分子蛍光検 出 (Science1983, 219, 845 847.)」の第一人者である Richard Keller 教授のグループで先端のフローサイトメトリー技術について研究を行っていました。 この科学的背景を基に、NanoFCM フローナノアナライザーの計測技術とアプリケーションが開発され、その後、NanoFCM フローナノアナライザーが 誕生しました。 開発には Xiaomei Yan 氏の他に、Shaobin Zhu 氏も大きく関わりました。彼は Xiaomei Yan 氏の研究に参加し、FCM 技術の実行可能性を示すための初期 のベンチトップ実験装置を構築しました。その後 NanoFCM Inc. は、Shaobin Zhu 氏らによって 2014 年に設立され、2020 年より私たちメイワフォーシス 株式会社が日本国内における販売を開始いたしました。

M、SEM、AFMでは試料の固定や染色が必要であり、形状や構造が不規則なウイルスなどの e Photon Counting Module) を搭載することで高感度化を実現し、側方散乱 (Side Scatter) プ解析を実現しています。 測定に対応しており、ナノ医薬品、ワクチン、遺伝子治療におけるウイルスベクター、 のバイオマーカー探索など広範な研究に利用されています。 ● TEM に匹敵する高分解能なサイズ分布計測 ● 蛍光 1 分子からの高感度フェノタイピング ● 60 秒間でのハイスループット測定

側方散乱光 (SS) と蛍光 (FL) の同時検出 ナノ粒子における「粒度分布」と「表現型」を解析 従来のフローサイトメトリー技術を改良して、ナノスケール解析に特化させたナノ粒子検出システムです。 検出器に SPCM(Single Photon Counting Module) を搭載することで高感度化を実現し、最小 7nm( 金粒子 ) からの粒子検出が可能です。 側方散乱 (Side Scatter) でサイズ、蛍光検出でフェノタイプを行い、単一ナノ粒子における粒度分布と表現型を同時解析します。 TEM と相関が高いサイズ分解能と濃度を取得 50 TEM NanoFCM 80 NTA 250 40 200 60 30 40 20 100 10 50 20 0 0 0 0 100 200 300 0 100 200 300 0 100 200 300 Diameter(nm) Diameter(nm) SiNP size(nm) 50 47 nm 500 50 59 nm 40 74 nm 95 nm 400 40 123 nm 30 300 30 20 200 20 10 100 10 0 0 0 40 60 80 100 120 140 40 60 80 100 120 140 0 100 200 300 400 Diameter(nm) Diameter(nm) Diameter(nm) ▲第一世代計測技術（TEM, NTA）との比較データ 【上図】95 nm シリカナノ粒子の比較測定の結果です。 NanoFCM はサイズ評価で信頼性が高い TEM と結果が一致します。 一方、NTA では 20-250 nm のブロードな測定結果となります。 【下図】サイズが異なるシリカナノ粒子（47, 59, 74, 95, 123 nm）をミックスし測定しています。 TEM と NanoFCM では 40nm から 140nm の範囲において、サイズ分布と濃度の高い相関性が見られます。 NTA では 47nm の粒子も検出されていますが、量的な定量性は測定することができておりません。 SiNPs Mixture 95 nm SiNPs Number of SiNPs(% of total) Number of SiNPs Events Events Events Events

側方散乱と２つの蛍光シグナルによる ナノスケールフェノタイピング 製品特長サイト 光散乱測定による粒子の物理的性質解析 5E+6- P1 44.9%, 92.0±26.1nm, 8.41E+7/mL サイズ分布、濃度解析 4E+6- 3E+6- 2E+6- 1E+6- 0- 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Size(nm) 5E+6- P2 1.7%, 54.8±6.5nm, 3.17E+6/mL 4E+6- Time(ms) 3E+6- 2E+6- 1E+6- 0- 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Size(nm) 5E+6- P3 14.2%, 55.5±12.4nm, 2.65E+7/mL 4E+6- 3E+6- Time(ms) 2E+6- 1E+6- 0- 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Size(nm) 5E+6- P4 39.2%, 78.5±17.7nm, 7.33E+7/mL 4E+6- 3E+6- 2E+6- 1E+6- Time(ms) 0- 蛍光測定による粒子の生物学的性質解析 40 60 80 100 120 140 160 180 200 単一粒子のマルチパラメーター検出 脂質、タンパク質、核酸の存在量 Size(nm) 側方散乱 (Side Scatter) でサイズ、2 色の蛍光検出によりフェノタイプ解析を実現しております。 1 つのナノ粒子に対して、SS と 2 色の蛍光を同時に検出することにより、ナノ粒子のフェノタイピング解析が可能です。 蛍光分子数の定量 (NanoFCM Flare & Auto20) Mixture of 212 nm Fluorescent Silica NPs Single Molecule Detection 30 Distilled Water 300 104 MESF 1560 15 814 300 0 103 324 30 133 R-PE 100 42 15 102 0 0 0 50 100 150 200 100 101 102 103 104 102 103 104 105 0 50 100 Time(ms) SS burst area(counts) SS-A Svents ▲ 212nm の蛍光性シリカナノ粒子混合物の同時測定結果 NanoFCM はサイズ分解能だけでなく、蛍光シグナルにおいても高い分解能と感度を有しています。 42 ～ 1560MESF の蛍光強度が異なる直径212nmのシリカナノ粒子を測定したデータからは、 42/133MESF の蛍光分解能を有していることがわかります。 また、PE1 分子の蛍光シグナルを検出可能です。 PC5 Intensity FITC Intensity SS Intensity FL-A FL(counts/bin) Events Concentration(/mL) Concentration(/mL) Concentration(/mL) Concentration(/mL)

核酸医薬 核酸医薬は低分子医薬、抗体医薬に次ぐ第 3 の医薬として有望視されており、核酸治療を 可能にするための安全かつ効果的なデリバリープラットフォームが日々開発されています。 NanoFCM は包括的な LNP 特性評価のためのプラットフォームとして、さまざまな研究開 発プロセスにおける核酸治療薬のワークフローに広くご活用いただけます。 LNPリガンド密度の定量 葉酸修飾リポソームをモデル系として、各リポソームにおける側方散乱（SSC）と蛍光シグナルを同時に取得し、 LNP の表面リガンド密度の解析を行いました。 SSC 強度の校正には多分散 SiNP を、FL 強度の校正には等価可溶性蛍光色素（MESF）が既知の蛍光 SiNP を使用し NanoFCM によって得られた高分解能のデータから、サンプルの粒子径とリガンドの密度を定量化することができます。 Chen C, Zhou Y, Chen C, et al. Quantification of Available Ligand Density on the Surface of Targeted Liposomal Nanomedicines at the Single-Particle Level. ACS nano, 2022, 16(4):6886-6897. ｍRNAの局在アッセイ mRNA-LNP製剤には3つの主要なサブポピュレーションが存在するため、 製剤化を行う為にはダウンストリームプロセスの最適化が重要となります。 NanoFCMを用いた蛍光標識戦略とそれに続くヌクレアーゼ処理によるmRNA局在アッセイによってmRNAの有効負荷を評価し、 高純度のmRNA LNPを得るための製剤評価が可能となります。

LNPsの核酸封入率定量 siRNA 送達のための脂質ナノ粒子 アプリケーション LNPs cryoTEM サイト cryoTEMによるsiRNA存在確認 LNPs NanoFCM SYTO82(膜貫通型核酸色素)によるsiRNA染色 siRNA を内封している LNPs の濃度を計測することが可能です。 そこから LNP に内封されている siRNA のコピー数を見積もることもできます。 Zhu S, Ma L, Wang S, et al. Light-Scattering Detection below the Level of Single Fluorescent Molecules for High-Resolution Characterization of Functional Nanoparticles. ACS Nano, 2014, 8(10):10998-11006. mRNA コピー数の測定とカプセル化効率 mRNA Copy Number NanoFCMは高い蛍光分解能を有しており、mRNA-LNPと遊離mRNAそれぞれのシグナル強度を識別し、 LNP1粒子の中に含まれているmRNA分子数を定量化することができます。 このデータではLNP1粒子あたり平均して12コピーのmRNAが含まれています。 Events

細胞外小胞(EV) 単一粒子ごとにフェノタイピング解析 NanoFCM は 100nm 未満の粒子を単一分子レベルで検出できる蛍光感度を有しています。 内在性蛍光および蛍光標識の両方について、EV1 粒子ごとに計測が可能で蛍光 EV 集団と 非蛍光集団を判別することが可能です。 タンパク質、核酸、脂質も単一粒子での評価が可能で、蛍光シグナル強度でその存在の 相対量を計測し、EV1粒子においての表現型決定 ( フェノタイピング ) を可能にします。 EV 存在量の定量化 CD63-EGFP CD9-AF488 800 600 30k 600 10k 400 20k 400 200 7.5k 200 0 5k 10k 0 SS-A Gating 2.5k SS-A Gating 0 100k 0 100 200 300 400 500 6481/7486 86.57% 0 1M 5738/7818 73.4% Time(ms) 0 100 200 300 400 500 10k Time(ms) 100k 2k 2k 1.5k 10k 1k 1.5k 1k 1k 1k 500 100 500 0 100 0 100 200 300 400 500 0 Time(ms) 10 0 100 200 300 400 500 10 100 1k 10k 100k 1M 10M 0 250 500 750 1k Time(ms) 20 100 1k 10k 200k 0 200 400 600 SS-A Events SS-A Events 上のグラフは EV 固有のマーカーのモデルタンパク質として CD9 および CD63 を使用し、 CD9 の存在は免疫蛍光標識、CD63 の存在は CD63-EGFP クローンから 抽出された EV を分析することによって確認した事例です。 蛍光集団と非蛍光集団を認識することができ、EV の存在量を定量評価することが可能です。 EV内miRNA量の評価 RNA Lipid 105 SS-A, FITC-A subset 105 SS-A, PE-A subset 35.6% 57.3% 104 104 103 103 102102 0 -102 102 103 104 105 101 SS-A 101 102 103 104 105 106SS-A EV は内部および表面に RNA、DNA、タンパク質、脂質、および代謝産物を含んでおり小胞貨物に例えられます。 上のグラフは SYTO RNASelect を用いて EV 内の mRNA と miRNA を標識し、PKH26 を用いて EV 表面の脂質を標識した事例です。 mRNA と miRNA の存在は FITC のシグナルから、EV かそれ以外の夾雑物かの区別は PE のシグナルから判断することができます。 これにより、蛍光標識した EV と非蛍光粒子を識別することで、サンプル中における粒子の素性を明らかにすることができます。 FITC Intensity SS Intensity FITC-A FITC-A Events FITC-A Gating FITC Intensity SS Intensity PE-A FITC-A Events FITC-A Gating

疾病早期診断への応用 細胞外小胞 (EV) は、その遺伝子情報から疾患の証拠となり得ます。 アプリケーション EV の表面タンパク質の蛍光解析が可能な NanoFCM は、 サイト EV の診断および治療の可能性を評価するための強力なツールです。 1. 大腸がん細胞株における CD147 の解析 正常な大腸細胞株と、大腸がん細胞株から抽出した EV における CD147 の発現を比較 Nomal Colorectal Cancer a b c d 106 106 106 105 CCD-18Co HCT15 HCT116 9.6% 105 51.4% 105 47.5% (796 events) (3,203 events) (3,179 events) 104 104 104 103 103 103 102 102 102 101 101 101 102　　103　　 104　　 105　　106 102　　103　　 104　　 105　　106 102　　103　　 104　　 105　　106 SSC(counts) SSC(counts) SSC(counts) 2. 血液中の EV 濃度 3. 血液由来 EV の CD147 解析 健常者および大腸がん患者血漿由来の EV の濃度比較 健常者および大腸がん患者血漿由来の CD147 陽性 EV の濃度比較 NS P<0.0001 106 8.0 106 1.5 n=32 n=37 CD147+ EVs : 902 events n=32 n=37 105 105 Ratio : 15.4% 80nm FL SiNPs 6.0 104 1,304 events 104 1.0 4.0 103 103 Extracellular Vesicles 0.5 1,897 events 2.0 102 102 101 0.0 101 0.0 102　　103　　 104　　 105　　 106102　　103　　 104　　 105　　 106 SSC(counts) CD147＋ Total EV Concentration n　 Lowest　 Highest　 Ratio　 Mean ±s.d Concentration n　 Lowest　 Highest　 Ratio　 Mean ±s.d althy donor　 32　0.6×107/mL 1.0×108/mL　 17　 (4.1±2.3)×107/mL 　 Healthy donor　 32　1.3×108/mL 5.3×109/mL　 41　 (0.9±1.2)×109/mL 　 Patients　　　 37　3.2×107/mL 12×108/mL　 38　 (2.9±2.9)×108/mL 　 Patients　　　 37　1.2×108/mL 6.2×109/mL　 52　 (1.2±1.2)×109/mL 　 Ratio　　　 　/　　　　/　　　　　　/ 　　　　/　 　　　　7.1 4. 早期診断と治療経過観察 （a）健常者および異なるがんステージにおける CD147 陽性 EV の濃度比較 （b）および腫瘍の摘出手術前後の患者血漿由来 CD147 陽性 EV の濃度比較 1.5 （a） 1.5 P<0.01 （b） P<0.05 P<0.001 P<0.0001 n=7 n=11 1.0 1.0 P<0.001 n=12 n=7 0.5 0.5 n=32 0.0 0.0 Healt hy do nor Stage I Stage II Stage III Stage IV Nano FCM は、単一の EV の側方散乱光および蛍光信号を同時に取得することを可能にし、さらに、100nm 未満の EV を含む サイズレンジの計測も可能にした唯一のフローサイトメトリーです。免疫蛍光標識後、NanoFCM の分析結果により癌などの 疾患において特異的にタンパク質が発現したサンプルの測定を行うことで、非侵襲的早期診断が可能になります。 参考文献 :[1] S Zhu, et al. ACS Nano, 2014, 8, 10998-11006. [2] Y. Tian, et al. ACS Nano, 2018, 12, 671-680. RBITC(counts) CD147 PE(counts) Conc.(×109 particles/mL) Conc.(×109 particles/mL) CD147 PE(counts) CD147 PE(counts) CD147 PE(counts) Conc.(×109 particles/mL) Conc.(×109 particles/mL)

ウイルス 基礎研究からワクチン生産評価まで ウイルスは DNAや RNAなどの核酸分子とタンパク質から構成され、ナノメートルスケール （20～200nm）の大きさ、高度な対称性、多価性、大量生産の容易さなどの特性から、 現在多くの研究者の注目を集めています。NanoFCM はウイルスのカプシドタンパクや 核酸、レンチウイルスのエンベロープなどへの標識プロトコルを有しており、ウイルスの 基礎的研究からウイルスベクター生産評価までの幅広い領域で単一ウイルスの高感度 ハイスループット解析を提供します。 NanoFCM によるレビウイルスMS2 のラベルフリー検出 サンプルとして非エンベロープウイルスであり、直径27㎜の正20面体一本鎖 (+) RNA ウイルスであるレビウイルス MS2( バクテリオリオファージ MS2）を使用し、 NanoFCM でのラベルフリー計測を行いました。 1 分間に検出されたすべてのナノ粒子の平均シグナル強度とバックグラウンド信号 （ノイズ）の標準偏差から算出した S/N 比は 11 であり、NanoFCM はバックグラウン ドノイズに対して MS2 ウイルスを高い感度で識別可能であることを示しています。 この結果は、NanoFCM が自然界に存在するほとんどのウイルスナノ粒子の検出要求 を満たす可能性を示しています。 T7 ファージのサブポピュレーション評価 膜透過性の核酸染色色素で T7 ファージの DNA に蛍光標識を行い、 フェノタイピングを行いました。DNA を持つ T7 Virion と T7 DNA は蛍光 (FL) 陽性です。 またシェルを有する T7 Virion と T7 empty capsid は粒子サイズに由来する SS シグナルが大きくなります。 これらのシグナルの違いから各サブポピュレーションを分離できます。 蛍光シグナルと粒度分布の同時解析によって、ビリオン、空のウイルスシェル、 遊離核酸の区別と各サブポピュレーションにおけるサイズや濃度も絶対値で知ることができます。

ナノマテリアル ナノ粒子の総合測定スイート 近年、合成ナノ粒子は多くの分野で広く使用されており、特に生物医学、光学、エレクトロニ クスなどで注目を集めています。これらのナノ粒子は高解像度イメージングや疾患診断、薬物 ターゲティング、環境モニタリングなどに役立っています。しかし、ナノ粒子の応用には毒性 の問題もあり、その安全性は粒径、形状、化学組成などに関連しています。 金ナノ粒子のサイズ微分と絶対定量 ▲GNP のフローサイトメトリー分析 金ナノ粒子は特に医療や生物学的分析で 注目を集めており、粒子サイズと濃度の 正確な分析が重要です。 TEM と DLS は一般的に使用される方法で すが、濃度の正確な測定手段が不足して います。 金 ナ ノ 粒 子 の 濃 度 は 通 常、TEM と ▲GNP の絶対定量化 ICP-MS または ICP-AES を組み合わせて 分析されますが、この方法は複雑で時間 がかかり、粒子の形状とサイズの不均一 性により正確さに欠けることがあります。 したがって、単一粒子数と試料の体積流 量を用いた標準試料を用いない粒子濃度 の絶対定量分析法が開発されました。 また、蛍光内部標準を利用した簡単な定 量法も開発されました。 ▲NanoFCM によって決定された比率と理論上の比率の関係

ラインナップ NanoFCM Flare ＆ NanoFCM Auto20 NanoFCM スタンダードモデル ●ラインナップ比較表 NanoFCM Flare NanoFCM Auto20 NanoFCM スタンダードモデル LNP中の核酸コピー数の定量 オートサンプラー・ 最大2つの蛍光標識 特長 リガンド密度の定量 クリーニング機能を搭載した （488 & 638nm）により ハイスループットモデル 粒子群を定量化 サイズ 〇 〇 〇 濃度 〇 〇 〇 フェノタイピング 〇 〇 〇 mRNAコピー数解析 〇 〇 × リガンド密度解析 〇 〇 × オートサンプラー・ × 〇 × オートクリーニング機能 仕様 (NanoFCM スタンダード, Flare, Auto20 共通 ) 基本情報 送液系 サイズレンジ 7～1,000 nm サンプルフローレート 2～60nL / min 必要サンプル容量 10～100 μL シース液フローレート 10～40μL / min 測定時間 最短60秒 サンプル導入 0.6mLEP チューブ 光学系 溶液積載許容量 シース液：1L 　　廃液：1L レーザー波長 488nm & 638nm クリーニング液：100 mL または 525nm & 638nm 流路メンテナンス スタートアップ、クリーニング、 レーザー形状 6μm × 24μm 楕円スポット 汚染除去、シャットダウンを自動化 フローセル 250μm × 250μm 直角フローセル ソフトウェアおよび構成情報 シグナルディテクター SPCM データ出力形式 NFA形式、FCS3.0形式 SSC※3感度 < 30nm ソフトウェア NF Profession SSC解像度 40 / 50nm 装置サイズ W 50.6 × D 34.6 × H 29cm サンプリングレート 12,000 events / min 重量 23.4kg 蛍光感度 FITC<10 MESF 電源 100～240V、50～60Hz、400W PE < 1 MESF 要求環境条件 温度：15～35℃、 湿度：< 80％ 蛍光解像度 42 / 133 MESF 蛍光フィルター ユーザーにて交換可能 本社 大阪事業所 名古屋事業所 23年10月移転 福岡事業所 23年10月開設 仙台事業所 TEL (03)5379-0051 TEL (06)6212-2500 TEL (052)854-7500 TEL (092)688-2229 TEL (022)218-0560 FAX (03)5379-0811 FAX (06)6212-2510 FAX (03)5379-0811 FAX (03)5379-0811 FAX (022)218-0561 meiwanet.co.jp 〒160-0022 〒542-0074 〒460-0003 〒819-0388　 〒981-3133 メイワフォーシス株式会社 新宿区新宿1-14-2 大阪市中央区千日前1-4-8 名古屋市中区錦1-5-11 福岡市西区九大新町5-5 仙台市泉区泉中央1-28-22 KI御苑前ビル 千日前M’sビル9F 名古屋伊藤忠ビル 712号室 いとLab+ 305 プレジデントシティビル3F meiwanet 検索 Lab 本社4F「テクノロジーラボ」／慶應義塾大学内 「ナノ粒子計測技術ラボ」／京都工芸繊維大学内 「表面解析ユニット」 ※テクノロジーラボ、ナノ粒子計測技術ラボ、表面解析ユニットへの連絡は本社までお願いいたします。※外見・仕様・その他について、予告なしに変更をする場合がございます。