ナノ粒子マルチアナライザー

Exoid ナノ粒子マルチアナライザー　仕様 Exoid ナノ粒子マルチアナライザー qEV 細胞外小胞抽出キット 本体 AFC qEVオートマチックフラクションコレクター 測定範囲 40nm～10μm 最小試料容量 30μL 製品カタログ 2021年9月現在 電源 100 V サイズ重量 W × 350 × D 350 × H 320 mm／ 10.5 kg APS 加圧／吸引圧範囲 0.01kPa～2.0kPa 標準モード（0.2kPa～2.0kPaの範囲） 0.05kPaステップ 加圧／吸引圧設定 微細モード（0.01kPa～0.2kPaの範囲） 0.05kPaステップ 「サイズ」「濃度」「表面電荷量」 推奨PC仕様 OS Windows® 10 Professional (64bit) プロセッサ 第四世代　Core i7／i5 推奨 メモリ 8 GB RAM 「粒子間相互作用」を計測 ビデオメモリ（VRAM容量） 1 GB以上　推奨 HDD 最小50GB以上　推奨 データ通信 USB2.0port 細胞外小胞抽出キット　qEVシリーズ　仕様 qEV single qEV original qEV 2 qEV 10 新製品 qEV 100 qEV single qEV single qEV original qEV original qEV 2 qEV 2 qEV 10 qEV 10 qEV 100 qEV 100 35 70 35 70 35 70 35 70 35 70 適正抽出サイズ 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm セパレーションサイズ 35 nm　　　 70 nm 35 nm 70 nm 35 nm 70 nm 35 nm 70 nm 35 nm 70 nm サンプル容量 100 ～ 150 μL 500 μL 2 mL 10 mL 100 mL 使用温度 18 ℃　～　24 ℃ Typically 0.25 mL / Typically 0.8 to 1.2 mL / Typically about 2.5 mL / Typically 4.0 to 5.0 mL / Typically Typically フローレート min at 20 ℃ min at 18 ℃ min at 18 ℃ min at 18 ℃ 11 mL / 15 mL / min at 20 ℃ min at 20 ℃ Void volume 1,000 μL ± 0.1 mL 3.0 mL ± 0.25 mL 12 mL 20 mL 150 mL Bed Volume 3.5 mL 10mL 47 mL 75 mL 750 mL 使用回数 1 回 5 回 5 回 5 回 5 回 Buffer PBS 最大通過粒径 1 μm トップとボトムの 20 μm フィルターサイズ pH仕様範囲 3 - 13 pHクリーニング 2 - 14 仕様範囲（CIP） 使用期限 12ヶ月 メイワフォーシス 株式会社 細胞外小胞測定に！ 製品、その他お問合せ先 本 社 : TEL (03)5379-0051 FAX (03)5379-0811 〒160-0022 新宿区新宿1-14-2 KI御苑前ビル 抽出～解析は１時間以内に完了 大 阪 本 部 : TEL (06)6212-2500 FAX (06)6212-2510 〒542-0074 大阪市中央区千日前1-4-8 千日前M’sビル9F 名 古 屋 営 業 所 : TEL (052)686-4794 FAX (052)686-5114 〒464-0075 名古屋市千種区内山3-10-18 PPビル3F 仙 台 営 業 所 最新の「細胞外小胞・OMV（アウターメンブレンベシクル）抽出方法」 技 術 開 発 セ ン ター : TEL (022)218-0560 FAX (022)218-0561 〒981-3133 仙台市泉区泉中央1-28-22 プレジデントシティビル3F 誰でも簡単な方法で、超遠心法の問題点を全て解決します。 テ ク ノ ロ ジ ー ラ ボ : 〒135-0064 東京都江東区青海2-4-10 東京都立産業技術研究センター 製品開発支援ラボ318　 慶應義塾大学-メイワフォーシス ナ ノ 粒 子 計 測 技 術 ラ ボ : 〒223-8522 神奈川県横浜市港北区日吉3-14-1 慶應義塾大学 矢上キャンパス理工学部中央試験所 36棟213号室 ※テクノロジーラボ、ナノ粒子計測技術ラボへの連絡は本社までお願いいたします。※外見・仕様・その他について、予告なしに変更をする場合がございます。

粒⼦１つ１つを測定して⾼精度な解析を実現 Exoid ナノ粒⼦マルチアナライザー qNanoからExoidへ 濃度（個数／mL）を定量評価 ◆⾃動制御機能を搭載した、新しいTRPS測定システム 再現性⾼く定量濃度評価 これまでqNanoでは⾼品質のデータを提供してきましたが、装置の適切な使⽤に求められるスキルとトレーニングについても指摘を受けてきました。そこで、Exoidは初⼼者に も使いやすいよう、圧⼒、電圧、細孔径の⾃動制御機能を備え、オペレーター1⼈の複数データや、複数のオペレーター間のデータのばらつきを軽減することで信頼性を⾼め Certificated Mean Diameter 400nm のNIST 標準粒⼦（ポリスチレン）を ました。研究施設内で幅広いご利⽤が可能で、従来に⽐べ最⼤2倍の⽣産性を実現します。 TRISバッファーに1000倍希釈したサンプルを5度に渡りExoidで測定し再現性が 得られるかを検証したデータです。 ◆TRPS技術をさらに進化 【測定条件】 qNanoより採⽤しているTRPS（Tunable Resistive Pressure Sensor）技術はそのままに、消耗品のナノポアを使⽤します。 NP200(推奨測定範囲100nm-400nm)使⽤、 Exoidの連続⾃動モニタリング機能があれば、ナノポアに詰まりが⽣じた場合などの問題を迅速に検出、対処することも可能になります。 Voltage: 0.46V／Stretch: 45.42mm／Pressure 9で測定 Run Measured Mean Measured ◆圧⼒モジュールの統合 Diameter Concentration qNano のVPM（プレッシャーモジュールシステム）に代わり、Exoidは新たに⾃動圧⼒ユニットを本体に統合し、正確性、⼀貫性、運⽤性を改善しました。 1 400.2 nm 2.5e+11 particles/mL 2 398.3 nm 2.4e+11 particles/mL ◆ハードウェアの改良 3 397.1 nm 2.5e+11 particles/mL 4 397.9 nm 2.6e+11 particles/mL ハードウェア再設計し、qNanoとの⽐較においてバックグラウンドノイズの⼤幅な軽減に成功しました。ダイナミックレンジが広がり、より⼩さい粒⼦検出の信頼性を⾼めました。 5 399.2 nm 2.4e+11 particles/mL ◆リアルタイムにキャリブレーション結果を評価 ⾃動キャリブレーションと新しいソフトウェアでリアルタイムにキャリブレーション結果を提供し、サンプルの状態、反応の進⾏、凝集の発⽣などを迅速に評価することができます。 １粒⼦毎の表⾯電荷を計測 TEMと同等の⾼精度サイズ分布計測を実現 図A ポリスチレン粒⼦の計測事例 １粒⼦毎のゼータ電位（mV）を定量化 左のグラフは、220、330、410nmのポリスチレンパーティクルをそれぞれ個別に計測した事例です。 従来のDLS技術を利⽤した表⾯電荷計測装置では、全分布の平均表⾯電 ExoidやDCSはTEMの計測結果との相関が⾮常に⾼く、⾼精度のサイズ分布を得ることができます。 荷量の計測しかできませんでした。 ⼀⽅、光散乱法を採⽤したDLS、PTAでは実際とは異なるブロードなサイズ分布しか得ることができません。 ExoidはTRPS技術により、粒⼦1つの表⾯電荷を計測することができ、従来の DLS技術と相関を持った表⾯電荷量計測(左表B)と同時に粒⼦１つ１つの TEM 透過型電⼦顕微鏡 表⾯電荷量も計測することも可能となりました。(左図A) DLS 動的光散乱法 TRPS Tunable Resistive Pulse Sensor (Exoid) ※ゼータ電位測定には、サンプルを条件に調整する必要があります。 PTA Particle Tracking Analysis DCS Differential Centrifugal Sedimentation 【関連文献】 表B Kozak et al. 【関連文献】 Simultaneous Size and ζ-Potential Measurements of Individual Nanoparticles in Will Anderson, Darby Kozak, Victoria A. Coleman, Åsa K. Jämting, Matt Trau Dispersion Using Size-Tunable Pore Sensors. ACS Nano, Just Accepted Manuscript DOI: 10.1021/nn3020322, Published Online: A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and July 18, (2012). resolution analysis of polydisperse particle size distributions. Journal of Colloid and Interface Science, Volume 405, 1 September 2013, Pages 322–330 1 2

最⼩サンプル30µLから ピペットを使⽤した簡単操作 Exoid ナノ粒⼦マルチアナライザー 原理も操作もシンプルなナノ粒⼦計測器 特許技術の可変調整（チューニング）できるナノポアを採⽤ 電気抵抗ナノパルス⽅式 サンプルの光学特性や形状に影響されません。 40nm〜10μmの粒⼦測定が可能 ①ナノポアを挟んだ電解溶液中に電圧をかけると  ポリウレタン製のナノポアを採⽤。ポアサイズのチューニングは⽬詰まり防⽌に有効です。   電流が流れます。 測定粒⼦サイズに応じて、各種ポアサイズを⽤意しています。 ②粒⼦がナノポアを通過すると電気抵抗ナノパルスが  発⽣します。 ③ナノパルスの⻑さは粒⼦の体積を⽰しており、  ⼤きな粒⼦であるほど⻑い電気抵抗ナノパルスを  ⽣じます。 stretch stretch  右図では⾚く⼤きな粒⼦が⼀番⻑いナノパルスを発 ⽣させ、緑の⼩さな粒⼦のナノパルスは短くなります。 ④専⽤の測定・解析ソフトはナノパルスを１つずつ 時間（msec）  カウントして、それぞれナノ粒⼦の体積から径を算出  しサイズ分布を求めます。 専⽤ソフトウェアで粒⼦1つ1つを測定し⾼精度な解析を実現 ナノポア種類 推奨測定範囲（nm） 推奨濃度（個数／mL） NP80 40 ー 255 1.00E+10 NP100 50 ー 330 1.00E+10 NP150 70 ー 420 5.00E+09 NP200 85 ー 500 2.00E+09 NP300 150 ー 900 1.00E+09 NP400 185 ー 1,100 5.00E+08 NP800 385 ー 2,050 1.00E+08 NP1000 490 ー 2,900 5.00E+07 NP2000 935 ー 5,700 5.00E+06 NP4000 1,990 ー 11,300 5.00E+05 ナノポア 3 4 電流値（nA）

夾雑物なく、インタクトな細胞外⼩胞抽出なら「qEV」 ※ qEV, AFCは基礎的研究⽬的で使⽤願います。臨床、医療⾏為には使⽤できません。 qEV 細胞外⼩胞抽出キット／ AFC (qEVオートマチックフラクションコレクター) qEV 細胞外⼩胞抽出キット qEVと他⼿法の⽐較が⽂献となりました。（⾎漿を各⼿法で処理し結果を⽐較） 医療機器の品質マネジメント国際標準規格 ISO 13485を取得 夾雑物を取り除き細胞外⼩胞本来の ⾼回収率で不要なタンパク質は除去 ⽇本で唯⼀！ISO規格で保証されたEV抽出キット カップ型形状を損なうことなく抽出 粒⼦／蛋⽩質割合によると、qEVを使⽤した結果が良好です。 抽出したサンプルのサイズ分布はいずれも、細胞外⼩胞のサイズ 他の⼿法では、汚染タンパク質も共同分離を⾏っていることがわかります。 細胞外⼩胞、 範囲内の粒⼦を検出しています。 ポリマー沈殿法と密度勾配沈殿法の⼿法では、粒⼦が多く存 Extracellular Vesiclesを15分で分離・精製 qEV 在していますが電⼦顕微鏡で画像を確認すると、細胞外⼩胞 Ａ⼿法 Ｂ⼿法 サンプル カラム内部にはポリマーのメッシュがあり、そのメッシュの表⾯には、無数の 以外の不純物が多く含まれていることがわかります。 導⼊⼝ ⾼ ⼩さな⽳が開いています。 い 適正抽出サイズより⼤きな粒⼦はメッシュで遮られるため、通過が遅れます。 Exoid測定 TEM画像 程 純 また、適正抽出サイズより⼩さな粒⼦はメッシュ表⾯の⽳に⼊るため、通 Ａ⼿法（ポリマー沈殿法製品） 度 過が遅れます。 が 処理後 マニュアル通りのタイミングで回収することで、15分の抽出時間で誰でも簡 ⾼ い サンプル排出⼝ 単に細胞外⼩胞の抽出が⾏えます。 Isolation method 研究⽤途やサンプル量により5種類から最適なキットをお選びいただけます。 正確に細胞外⼩胞の粒⼦のみを回収 Ｂ⼿法（分離カラム製品） qEV single qEV original qEV 2 qEV 10 新製品 qEV 100 50μgの蛋⽩質の「Western blot」解析によると、3つのメソッドにおい qEV single qEV single qEV original qEV original qEV 2 qEV 2 qEV 10 qEV 10 qEV 100 qEV 100 ても「Calnexin」の存在は⾒られませんでした。しかし、細胞外⼩胞の 35 70 35 70 35 70 35 70 35 70 適正抽出サイズ 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm 35～350nm 70～1000nm 存在を⽰す、「Flotillin-1」については、qEVの結果でのみ検出されま セパレーションサイズ 35 nm　　　 70 nm 35 nm 70 nm 35 nm 70 nm 35 nm 70 nm 35 nm 70 nm した。 他の⼿法の結果では⾮細胞外⼩胞含有蛋⽩質の存在は、⼤ サンプル容量 100 ～ 150 μL 500 μL 2 mL 10 mL 100 mL 量の「Albumin」の存在によって判明しましたが、「Albumin」はqEV 使用温度 18 ℃　～　24 ℃ サンプルではほとんど⾒られませんでした。 Typically 0.25 mL / Typically 0.8 to 1.2 mL / Typically about 2.5 mL / Typically 4.0 to 5.0 mL / Typically Typically フローレート qEV min at 20 ℃ min at 18 ℃ min at 18 ℃ min at 18 ℃ 11 mL / 15 mL / 細胞 Ａ Ｂ min at 20 ℃ min at 20 ℃ qEV 溶解液 手法 手法 Void volume 1,000 μL ± 0.1 mL 3.0 mL ± 0.25 mL 12 mL 20 mL 150 mL Bed Volume 3.5 mL 10mL 47 mL 75 mL 750 mL 使用回数 1 回 5 回 5 回 5 回 5 回 Buffer PBS 細胞外⼩胞存在 最大通過粒径 1 μm トップとボトムの 20 μm フィルターサイズ 【 qEVと他手法との細胞外小胞抽出比較参考文献 】 pH仕様範囲 3 - 13 Richard J. Lobb; Melanie Becker; Shu Wen Wen; Christina S. F. Wong; Adrian P. pHクリーニング 2 - 14 Wiegmans; Antoine Leimgruber; and Andreas MÖller. 仕様範囲（CIP） Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. ⾮細胞外⼩胞含有蛋⽩質 Journal of Extracellular Vesicles. 2015, 4: 27031 使用期限 12ヶ月 5 6

これまでの細胞外⼩胞抽出を変える 「世界初」EV⾃動回収装置の登場 ※ qEV, AFCは基礎的研究⽬的で使⽤願います。臨床、医療⾏為には使⽤できません。 qEV 細胞外⼩胞抽出キット／ AFC (qEVオートマチックフラクションコレクター) qEV+Exoidを使⽤すれば、精製+解析は1時間以内に完了 AFC qEVオートマチックフラクションコレクター 従来細胞外⼩胞の抽出から粒度分布、濃度の定量測定は難しく、研究者が様々な⼿法を模索している状態でした。 qEVとExoidを併⽤してお使いいただく事で、細胞外⼩胞の抽出と粒度分布／濃度測定の問題を解決することが出来ます。 EV分離 Exoid測定・解析 結果 新製品 抽出〜クリーニングまで⾃動。 50 完 0 20 了 1 ま 時 で 間 EVの抽出作業がより簡単になります。 min min min 以内︕ AFCは重量による検出でフラクションを⾃動で回収していく為、作業 による差も発⽣しにくくなり、これまで以上の再現性を獲得できます。 Load 500μL of Collect EVs Process Raw また、AFCにはRFIDタグ（情報を保存できるICタグ）があり、製 sample 3x 500μL in PBS Load 35μL data files 造およびQAデータ、使⽤回数やクリーニングサイクルを管理します。 世界初！ 新製品 EV自動抽出システ ム RK-1 リージェントキット ナノポアへの⾮特異的結合を抑えるIZON塗布液(ICS)付属 qEVの抽出・洗浄作業が マニュアルからオートに！ RK-1未使⽤結果 RK-1使⽤結果 AFC （qEVオートマチックフラクションコレクター ) Exoid ナノ粒⼦マルチアナライザー qEV 細胞外⼩胞抽出キット 新しいソフトウェア(IZON Control Suite Ver. 3.2)に追加されたアシスタント機能に対応しています。最適化されたキャリブレーションサンプルやバッ ファーで⼈為的エラーやコンタミを極限まで抑えられます。また、ナノポアへの⾮特異的な結合を抑えるIZON塗布液も付属しています。新ソフトウェ ア(Ver.3.2)、qEV細胞外⼩胞抽出キットと合わせて、細胞外⼩胞の抽出から測定までトータルにプロトコルをご提供できます。 7 8

ク質 ンパ ス・ タ ・ 血液 学 機能性・高性能化DDS開発に 洗浄殺菌や新規DDSの開発に 高分子修飾リポソーム測定 ウルトラファインバブル計測 海洋環境で測定 Exoidでは最小20mMからのNaCl溶液で測定することが可能です。 採取した海水を直接測定も可能で、海水中に含まれるウィルスや ナノバクテリア、海洋有機物の測定が可能です。 単細胞シアノバクテリア バクテリアサイズ：680 nm 濃度 = 5.6 x 108 個/mL 海洋中ナノ有機物の測定 水浄化やプロテインスキマーの評価 詳細は 15ページ 参考文献 Roverts GS, Yu S(Izon Science Ltd), Zeng Q (マサチューセッツ工科大学), et., al, Tunable Pores for Measuring Concentrations of Synthetic and Biological Nanoparticle Dispersions Biosensors and Bioelectronics, Volume 31, Issue 1,15 January 2012, Pages 17-25 海洋ナノバクテリア粒度測定 バブルの分散状態と濃度を計測 微生 1μm以下の微細な気泡のナノバブルは、気泡を tem 物・ 形成しているガスの種類によって、殺菌効果 ys ウイ 飲料・食品の評価 や生理活性作用、DDSなど、今後の産業分野 y S ●バクテリア ル 詳細は 表面修飾による電荷量変化の測定 への応用が期待されています。 er 14ページ ●リポソーム 大腸菌、乳酸菌 粒度分布が幅広いナノバブルですが ●ミセル 海洋バクテリア等 標準的なミルク（青棒）にはカゼインミセルやラク PEGを加える前後で、リポソームの表面修飾変化をExoidで捉えること それらを正確に個数分布を分析 ●脂質 ●ウイルス トース、脂肪球などが含まれており、幅広い粒度分布 ができます。上図はPEGの修飾により、リポソームの電気泳動移動度 することが可能です。 ● PLGA, PLG アデノウイルス サイトメガロウイルス を示します。 (粒子の表面電荷量)に低下がみられ(緑棒)、表面電荷が減少している 詳細は ●ナノバブル ●マイクロバブル バキュロウイルス 加工ミルク（緑棒）には粒子サイズが大きい成分が ことを示しています。 13ページ バクテリオファージ等 ●カプセル 少ないことがわかります。しかし標準的なミルクの ●ウイルス様粒子(VLP) ピークに近いところにピークを確認することができる 迅速診断・疾病マーカーの開発に ●L-b-Lポリマー ワクチン ●エマルション 食品 ことから、ミルクの主成である脂質球が含まれている 牛乳と加工乳の比較 細胞外小胞測定 (水ベース) タンパク質結晶 ことが推測できます。 色素A 広がるExoidの測定事例 色素B 顔料の評価 ●細胞外小胞 ●高分子ビーズ ●血小板 ポリスチレン 尿・血清中の NIPAM ●赤血球 2種類の色素の測定評価の結果です。 細胞外小胞を測定 ●磁性粒子 ●血漿 色素Aは550nm付近、色素Bは220nm付近に ●セラミクス粒子 血液や尿、唾液等の体液中に存在 ●血清 ピーク値が存在します。2つの色素でサイズ シリカ する微小胞の細胞外小胞は体内の ●ベシクル チタニア 分布とサイズ毎の濃度に大きな違いがある 色素の分散比較 様々な部位から発生し、その疾病由来 ことがわかります。 ●細胞 ●フィルター濾過水 マーカーとして期待されています。 迅 ●洗浄液 Exoidは様々な体液からその存在をサイズ 分布と濃度、抗体反応で測定することができます。 速 ・ 左図は尿中の細胞外小胞を測定したグラフです。 診 機 詳細は 断 有 11ページ 多分散ポリマービーズ 詳細は In situで分子間の相互作用を 17ページ リアルタイムモニタリング 4種類の大きさのポリスチレン粒子を混ぜた懸濁液を 測定した結果です。Exoidは粒子1個ずつを計測する電気 ナノポアを粒子が通過する時間は粒子の表面電荷量によって変化しま 抵抗ナノパルス法を採用しているため、粒径レンジの す。この変化量を見ることで、粒子と分子の相互作用を測定します。 広い多分散サンプルでも高分解能で測定が可能です。 右図は、マイナス電荷のカルボキシル化ポリスチレン粒子の計測10分後に プラス電荷のアビジンを滴下した時のナノポア通過時間を計測したグラ フです。アビジンの吸着により通過時間が長くなったことを示しています。 詳細は 14ページ 測定粒子のSEM画像 9 高分子粒子とタンパク質の相互作用測定 多分散サンプルでも高分解能にサイズ分布を検出 10 Drug Deliv 無機材料

広がるExoid測定事例 細胞外⼩胞（採取場所：尿、⾎清、培養細胞等々） Exoidは他⼿法では規定値外の低濃度サンプルでも計測が可能 表⾯電荷の測定で細胞外⼩胞の種類を識別 Exoidは1回の測定で必要なサンプル量は、30μLと少量でもサイズ・濃度を定量化します。濃度不明の細胞外⼩胞を計測する場合が多いですが、Exoid では対象サンプルが低濃度の場合でも計測不能となることなく絶対値で濃度を出すことができます。貴重なサンプルを無駄にすることがありません。 比較項目 Exoid 他社 （電気抵抗ナノパルス法） （ナノ粒子トラッキング法） 105個低数／m測定サンプル濃度 濃度Lで以上もからの 規定値 低 107個数／mL以上 測濃度定でがもで測き定ま可す能※ でないと計測自体不能 必要サンプル量 30μL 500μL ※測定できる濃度の下限値はナノポアの種類によります。 細胞外⼩胞の関連⽂献 Takeshi Katsuda, Reiko Tsuchiya, Nobuyoshi Kosaka, Yusuke Yoshioka, Kentaro Takagaki, Katsuyuki Oki, Fumitaka Takeshita, Yasuyuki Sakai, Masahiko Kuroda & Takahiro Ochiya Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells secrete functional neprilysin-bound exosomes. Scientific Reports 3 Article number:1197 (doi: 10.1038/srep01197) いくつかの癌細胞由来のEVがリン脂質の再編成を⽰すことが知られており、異なる脂質の表⾯電荷の変化を検出することができることで、 Shimbo K, Miyaki S, Ishitobi H, Kato Y, Kubo T, Shimose S, Ochi M. EVの同定および起源の同定に特に有⽤になる可能性があります。 Exosome-formed synthetic microRNA-143 is transferred to osteosarcoma cells and inhibits their migration. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Mar 7;445(2):381-7. doi: 10.1016 / j.bbrc.2014.02.007. Epub 2014 Feb 10. グラフ(A)は、HumanCSF由来の細胞外⼩胞の粒径と濃度を測定したグラフです。こちらのグラフからは単分散のプロファイルを⽰します。 細胞外⼩胞のサイズ・濃度を定量評価 グラフ(B)は、グラフ(A)のY軸を半値全幅（FWHM）値に変更しているグラフです。FWHM値は表⾯電荷の1次情報です。より⼤きな FWHMは、それが細孔をよりゆっくりと横切ることを⽰し、したがって、負に帯電しにくいことを⽰します。 グラフ(B)を⾒ると2つの集団が⾒られます。これは実際にはサンプル中に2つの異なるEVタイプが存在することを⽰しており、サイズ分析のみ では識別されない違いです。個々の粒⼦を測定するExoidのみが可能な1度の測定で⼤量の情報を得る⼿法です。 細胞外⼩胞１粒⼦毎のゼータ電位を測定（human CSFの測定結果） 細胞外⼩胞診断デバイスの開発を⽬指し、Exoidを⽤いて細胞外⼩胞の 濃度・粒径分布を計測した事例です。 左のグラフはヒト⾎清を110,000×g,70 minで超遠⼼した後に、220nmの フィルターにかけて抽出した細胞外⼩胞を計測した結果です。 【資料御提供】 東京⼤学 ⼤学院 ⼯学系研究科 バイオエンジニアリング専攻 ⼀⽊ 隆範様 ●疾病由来細胞外⼩胞 ●健康的な細胞外⼩胞 ●キャリブレーション粒⼦ 左のグラフの■で⽰したグラフは抗体が細胞外⼩胞に結合することで、細胞 外⼩胞の表⾯電荷量が変化し、ナノポアの通過時間が遅くなっていることを ⽰しています。 細胞外⼩胞のみ(■)と細胞外⼩胞に⾮特異的な抗体を混ぜて計測したサ ンプル(■)と⽐較してもナノポアの通過時間が遅くなっています。回収された Exoidでは、ゼータ電位の1粒⼦毎の測定が⾏えます。健康的な細胞外⼩胞と疾病由来の細胞外⼩胞は表⾯電位が異なると考えられています。 粒⼦が疾病由来の細胞外⼩胞であることが確認できます。Exoidでは抗体 Exoidで測定することで、1粒⼦毎のゼータ電位の傾向から細胞外⼩胞の状態を予測することが出来ます。 を使⽤して計測した⽣体粒⼦の特定や抗体の評価ができます。 上図では、紫のドット(疾病由来の細胞外⼩胞)は値が固まっており、緑のドット(健康的な細胞外⼩胞)は値に広がりがあることがわかります。 11 12

広がるExoid測定事例 Drug Delivery System ナノキャリア：リポソーム、シリカ、ナノバブル等々 迅速診断・タンパク質 測定事例： ⾎⼩板、⾚⾎球、⾎漿、⾎清、ベシクル、細胞  リポソーム アプタマー開発に ターゲット物質との相互作⽤解析 ■凍結前のリポソーム ■凍結後のリポソーム リポソームの凍結前後をサイズと濃度で⽐較 左のグラフは凍結前と後のリポソームの粒⼦サイズと濃度を⽰しています。 単分散であったリポソームは凍結によって凝集量が増加し、多分散になっている ことがわかります。また凝集量の増加によりサイズ別の濃度も⼤きく変化してい ることがわかります。 サンプル 濃度(particles/mL) リポソーム 3.5×1013 リポソーム（凍結後） 2.9×1013 全体濃度から凝集割合の評価 凍結前と凍結後のリポソームの粒⼦濃度を⽰したのが上表です。リポソームは 凍結によってアグリゲーション量が増加し濃度が薄くなっている事がわかります。 アプタマーは⾼い特異性でターゲット分⼦と結合する核酸やペプチドで、医療診断や環境モニタリングの分野への応⽤が期待されています。 アプタマーを修飾したナノ粒⼦とターゲット分⼦の相互作⽤を粒⼦１つの電気泳動移動度から解析ができ、粒⼦サイズと濃度、ゼータ電位 の変化をナノモルレベルの感度で検出することができます。 上図は、DNAアプタマー修飾したナノ粒⼦とターゲットタンパク質のトロンビンの相互作⽤解析です。ナノモーラー(nM)の極低濃度の検出が 実現しました。 リポソーム表⾯の電荷計測 【関連文献】 Billinge et al. 左のグラフはリポソームとPEG修飾リポソームの計測結果です。 Monitoring Aptamer–Protein Interactions Using Tunable Resistive Pulse Sensing. 右下の2Dグラフは横軸にサイズ、縦軸に表⾯電荷量をゼータポテンシャルで Analytical Chemistry, 2014, 86 (2), pp 1030–1037 定量化したものを⽰しています。 それぞれ、サイズと電荷量別に濃度を算出することができます。 飲料の評価 測定事例：ビール、ミルク 新規DDSの開発（UFB：ウルトラファインバブル、エマルジョン） Sample 1 Sample 2 Sample 3 Particle Diameter(nm) Particle Diameter(nm) ウルトラファインバブルの分散状態と濃度を測定 エマルジョンのサイズ・濃度計測 1μm以下の微細な気泡のウルトラファインバブルは、気泡を形成してい ⾷品・化粧品・医薬品等様々な分野で利⽤されるエマルジョ るガスの種類によって、殺菌効果や⽣理活性作⽤、DDSなど、今後の ンですが、近年エマルジョン技術を応⽤したDDSキャリア開発 飲料⽔中の粒⼦を測定することで、品質の評価などに利⽤されています。 産業分野への応⽤が期待されています。従来の光学的測定⼿法では が期待されています。 上記グラフは市販のビールを3種類測定したデータです。3種類とも近い粒度分布となっていることがわかりました。 再現性が悪く、測定が難しかったのですが、Exoidでは粒度分布が幅 ■Sample1の粒⼦数は他のSampleより濃度が低いことがわかります。 広いウルトラファインバブルを正確に測定することができます。 13 14 Concentration(particles/mL) Concentration(particles/mL)

広がるExoid測定事例 微⽣物 バクテリア（⼤腸菌、乳酸菌、海洋バクテリア）、酵⺟、藻類 ウイルス アデノウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ等 形状の異なるバクテリアの確認 （枯草菌と芽胞） ウイルスの凝集状態を⾼分解能で評価 1量体 電気抵抗ナノパルス⽅式を使⽤して、ナノ粒⼦を１個ずつ測定するため、 レーザー⽅式のようなフィッティングが不要で⾼精度の測定が可能になりま した。左図はアデノウイルスの測定事例です。 ほとんどが90-100nmの範囲にありますが、２番⽬のピークが２つのウイ ルスがアグリゲーションした110nm(単⼀粒⼦の体積の２倍に相当)に⾒ られます。 2量体 【関連文献】 Robert Vogel, (クイーンズランド大学), et., al, Particle Diameter(nm) Particle Diameter(nm) Quantitative Sizing of Nano/Microparticles with a Tunable ▲枯草菌計測グラフ（A) ▲枯草菌計測グラフ (B) Elastomeric Pore Sensor.  サイズ（nm）vs 濃度グラフ（個数／mL）  サイズ（nm）vs 通過時間（ms） Anal. Chem., 2011, 83 (9), pp 3499‒3506 芽胞は⼀部の細菌が形作る、極めて耐久性の⾼い細胞構造です。 左側(A)のグラフでは、1.1μm付近に芽胞、2μm付近に枯草菌が⾒られます。 サイズ(横軸)と通過時間(縦軸)を表した(B)のグラフも、それぞれ芽胞と枯草菌が確認できます。球形に近い芽胞に⽐べて、円筒形の枯草菌は 経⼝ワクチンの品質管理 通過時間にばらつきがあります。これは、ナノポアを通過する際に、円筒形の枯草菌の向きによって通過時間が異なることから⾒られます。 経⼝ワクチンの⽣産時に品質を評価するために使⽤されています。 下図は、6つの製造容器から経⼝ワクチンを採取し計測した結果です。試料の分散に関する情報に加えて、正確な検体濃度（個数／mL）を バイオフィルム形成評価 各サンプルで求めることができます。さらに粒⼦の平均粒径、全濃度を求めることもできます。 バクテリアのサイズ評価 表⾯電荷の評価 電気泳動移動度（ms） Exoidはバクテリアのサイズと⾼精度濃度計測に加 えて、最新の事例でバイオフィルム形成のメカニズム 解明とコントロールのために利⽤されています。 バイオフィルムの第⼀段階は表⾯への接着です。 バクテリア付着と表⾯電荷の影響を決定するために Exoidでは表⾯電荷を電気泳動移動度(ms)から 評価することができます。 【関連文献】 Chung MC, Dean S, Marakasova ES, Nwabueze AO, van Hoek ML. Chitinases Are Negative Regulators of Francisella novicida Biofilms. PLoS One. 2014 Mar 24;9(3):e93119. doi: 10.1371 / journal.pone. 0093119. バクテリアの確認と存在量の⽐較 左のグラフはExoidでMethylobacterium sp.(■)とSphingomonas sp.(■)とその 混合物(■)をExoidで計測した結果です。 サイズが異なるバクテリアでは、それぞれのバクテリアの存在を⾼精度のサイズ分布で確 認することができます。またその存在を濃度で定量することができ、殺菌剤の開発や共 ⽣時の存在⽐を簡単に計測することができます。 ▲ 経⼝ワクチン測定グラフ：サイズ(nm) vs 濃度グラフ(個数／mL) 測定事例（ウイルス） バクテリア計測グラフ：サイズ(nm) vs 濃度グラフ(個数/mL) アデノウイルス 、MS2ファージ 、H7N3 、レンチウイルス 、⽔痘帯状疱疹ウイルス 、EV71 、バキュロウイルス 、ロタウイルス 、 VLPs 、HIV 、CMV 、HSV（淡⽔・海洋ウイルス） 、デング熱ウイルス 、H1N1 Particle Diameter(nm) 15 16 Concentration(Particle/mL) Concentration(Particle/mL) Blockade Baseline Duration(ms)

広がるExoid測定事例 有機・無機物質 ⾼分⼦ビーズ (ポリスチレン、NIPAM)、磁性粒⼦、セラミクス粒⼦ (シリカ、チタニア) 、フィルタ ー濾過⽔、洗浄液、ナノワイヤー、カーボンナノホーン サンプルの材質、光学特性、形状に関わらず⾼精度に計測 コアシェルナノ粒⼦の測定事例 Au@Tio2 Ag@Tio2 コアシェルナノ粒⼦は、2種の材料でナノ粒⼦ を作成する技術で、コアのサイズ、形状、厚み などから粒⼦⾃体に様々な特性を持たせるこ とが出来る為、触媒など様々な分野での応 ⽤が期待されています。  ⼀般的に粒⼦のサイズ測定でDLSが使⽤ されていますが、光を使⽤した測定の為、DLS ではサンプルの⾊や形状により、測定結果に 影響を受けてしまいます。特にコアシェルナノ粒 ⼦は、屈折率が異なる2個の材料からできて いる為、DLSでの測定は⾮常に困難です。  グラフは⾦ナノ粒⼦と銀ナノ粒⼦をTiO2でコー ティングしたコアシェルナノ粒⼦です。Exoidの 0E-5　　5E-5　　10E-5　　15E-5 20E-5　　25E-5 30E-5 TRPS法であれば光学や形状にかかわらず1粒 粒径（nm） 体積（fL） ⼦ごとのサイズを⾼分解能に測定することが出 極⼩ポリスチレンビーズ 来ています。 電気抵抗ナノパルス法により１粒⼦毎の体積を計測するので、サンプルの材質や光学特性、形状に関わらず⾼精度に計測が可能です。 粒径だけではなく、体積(fL)でヒストグラム表⽰・解析させることも可能です。⾼精度なサイズ分布の計測は、分散剤の開発にも有効です。 【関連文献】 Synthesis and characterization of noble metal–titania core–shell nanostructures with tunable shell thickness. Bartosz Bartosewicz, Marta Michalska-Domańska, Malwina Liszewska, Dariusz Zasada and Bart łomiej J. Jankiewicz Beilstein J. Nanotechnol. 2017, 8, 2083–2093. doi:10.3762/bjnano.8.208 ナノロットの測定事例 カーボンナノホーン 右図はカーボンナノホーンをExoid（TRPS）、DLS、TEMで計測した事例です。 DLSでは、ExoidやTEMと⽐べて⼤きなサイズにピーク値が出ており、サイズ分布も 広くなっています。ExoidではTEMと⾼い相関を持って計測することができます。 CNT（カーボンナノチューブ）の測定事例 ⅰ)粒子 粒径2μ ⅱ)粒子 粒径0.955μm ⅲ) Au rod 長さ4.7μm、CV 14%／直径290nm、CV15% ⅳ) Au rod 長さ2.15μm、CV 20%／直径350nm、CV 15% Exoidでは、試料がポアを通過した際の電気抵抗の変化より測定を⾏っています。こちらを利⽤してナノロットの様な球形ではない試料の測定も⾏う事 が出来ます。試料がポアを通過した際にパルスが発⽣します。このパルスの⼤きさが試料の「容積」、パルスの幅が「⻑さ」を⽰します。ナノロットと粒⼦が 混ざっている試料でも、形状の⽐較を⾏う事が出来ます。 CNTをExoidで測定した結果です。Exoidで測定したデータをソフトウェアで編集することで、X軸を粒⼦サイズ(nm)から容積(fL)へ変更することが 【関連文献】 Resistive Pulse Sensing of Analyte-InducedMulticomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores. 出来ます。試料の直径がわかっていれば、容積より試料のアスペクト⽐を求めることが出来ます。 Mark Platt, Geoff R. Willmott, and Gil U. Lee Small. 2012 Aug 6;8(15):2436-44. doi: 10.1002/smll.201200058. Epub 2012 May 9. 17 18