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アプリケーションノート Octet HTXシステムによるクロス競合エピトープビニングアッセイ

ホワイトペーパー

Octetシステムは、アッセイ速度、アッセイ設計の多様性、および並 列で独立したバイオセンサーの組み合わせにより、クロス競合アッセ イの実行に最適です。

エピトープビニングとは、各抗体が結合する抗原領域またはエピトープに基づいて、モノクローナル抗体のパネルをビンに区分することを指します。このグルーピングは、特定の抗原に対する抗体ペアの競合的結合が特徴付けられる、クロス競合アッセイを使用して行われます。

あるモノクローナル抗体の抗原結合が別のモノクローナル抗体の結合を妨げる場合、これらのモノクローナル抗体は類似または重複するエピトープに結合すると見なされます。逆に、モノクローナル抗体の抗原への結合が別のモノクローナル抗体の結合を妨害しない場合、それらは異なる重複しないエピトープに結合すると見なされます。モノクローナル抗体を同じビンに割り当てるには、2つの基準を満たす必要があります。

まず、同じビン内のすべてのモノクローナル抗体は、抗原に対する結合能をお互いブロックする必要があります。 第2に、同じビン内のすべてのモノクローナル抗体は、パネル内の他のモノクローナル抗体とペアにすると、同様のブロッキングプロファイルを持つはずであるということです。

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ドキュメント名 アプリケーションノート Octet HTXシステムによるクロス競合エピトープビニングアッセイ
ドキュメント種別 ホワイトペーパー
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アプリケーションノート 16 Octet HTX システムによる クロス競合/エピトープビニングアッセイ Rashi Takkar, Amrita Yadav, and Sriram Kumaraswamy, ForteBio; Sindy Liao-Chan and Jan-Willem Theunissen, Igenica, Inc. 目次 イントロダクション イントロダクション ................................................................... 1 エピトープビニングとは、各抗体が結合する抗原領域またはエピトー OCTET HTX ................................................................................ 2 プに基づいて、モノクローナル抗体のパネルをビンに区分することを ELISAとSPRに対する利点 .......................................................... 2 指します。このグルーピングは、特定の抗原に対する抗体ペアの競合 的結合が特徴付けられる、クロス競合アッセイを使用して行われま クロス競合アッセイ/ビニングアッセイの開発 ................................ 3 す。あるモノクローナル抗体の抗原結合が別のモノクローナル抗体の  適切なアッセイ形式の選択 ......................................................... 3 結合を妨げる場合、これらのモノクローナル抗体は類似または重複す  In-tandem アッセイ..................................................................... 3 るエピトープに結合すると見なされます。逆に、モノクローナル抗体  適切なバイオセンサーの選択 .............................................. 4 の抗原への結合が別のモノクローナル抗体の結合を妨害しない場合、 それらは異なる重複しないエピトープに結合すると見なされます。モ  抗原ローディングまたは抗原固相化 .................................... 5 ノクローナル抗体を同じビンに割り当てるには、2つの基準を満たす必  バイオセンサーの水和 ........................................................ 5 要があります。 まず、同じビン内のすべてのモノクローナル抗体は、  ベースライン ...................................................................... 6 抗原に対する結合能をお互いブロックする必要があります。 第2に、  抗原活性の確認 ................................................................... 6 同じビン内のすべてのモノクローナル抗体は、パネル内の他のモノク ローナル抗体とペアにすると、同様のブロッキングプロファイルを持  アソシエーション ............................................................... 6 つはずであるということです。  Classical sandwichアッセイおよびPremix アッセイ ....................... 7 創薬研究の初期ステージでは、数百もの抗体クローンを特徴づけるた  適切なバイオセンサーの選択 .............................................. 8 めにクロス競合アッセイが使用されており、ハイブリドーマ上清、  抗体ローディングまたは抗体固相化 .................................... 9 ファージライセート、または精製サンプルを用いて実施することがで  バイオセンサーの水和 ........................................................ 9 きます。異なるビンのモノクローナル抗体は異なるエピトープに結合  ベースライン ...................................................................... 9 し、多様な機能的特性を示します。そのためエピトープビニングの研 究は、望ましい生物学的活性を持つリード抗体を選択する可能性を高  抗体活性の確認 ................................................................... 10 めることができます。バイオシミラーまたはバイオベター生産のよう  アソシエーション ............................................................... 10 に、以前に特徴付けられたモノクローナル抗体と類似のエピトープに  抗体間の交差反応性 ............................................................ 10 結合するモノクローナル抗体を識別するためには、クロス競合アッセ バイオセンサーの再生 ................................................................... 11 イも実行されます。これらのアッセイは、同時に抗原に結合する良好 な抗体ペアを特定できるため、バイオマーカー試験や薬力学的アッセ クロス競合/エピトープビニングアッセイの実行 ............................ 12 イに用いられるような、サンドイッチやELISAタイプのアッセイ用の試  In-tandem .................................................................................. 14 薬を選択するのにも役立つかもしれません。  Classical sandwich ........................................................................ 14  Premix ....................................................................................... 14 Data Analysis ソフトウェア(バージョン 8.0 以降).......................... 15  解析データのエクスポート ........................................................ 16 結論 .............................................................................................. 20 References ..................................................................................... 20 1
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ステムは8、16、32、48、96ウェルを並列して読み取る能力があ Octet HTX り、試験デザインを調整することで分析スループットまたは感度を最 Octet®システムは、アッセイ速度、アッセイ設計の多様性、および並 大化できます。 8および16バイオセンサーモードは、低分子またはペ 列で独立したバイオセンサーの組み合わせにより、クロス競合アッセ プチド結合相互作用の測定が可能な高い感度を提供し、タンパク質定 イの実行に最適です。動作原理はバイオレイヤー干渉法(BLI)という 量を1ステップではng/mL、マルチステップアッセイではpg/mL程度 ラベルフリーテクノロジーに基づいており、定量分析やカイネティク まで行うことができます。Octet HTXは、2か所のサンプルプレートポ ス分析の目的で、分子相互作用をリアルタイムで測定します。相互作 ジションを備えており、自動化も可能です。Octetアッセイで使用さ 用の分析は、必要なスループットと利用可能なサンプル量に応じて、 れるDip and Read™バイオセンサーは、再生およびセンサートレイに 標準的な96ウェル、ハーフエリア96ウェル、標準的な384ウェル、ま 戻すことができ、測定の柔軟性を最大限にし、運用コストの節約がで たは傾斜底384ウェルマイクロプレートで実行できます。384ウェル傾 きます。さらに、マトリックス生成、ビンチャート、ビニングトレー 斜底マイクロプレート(ForteBio, PN 18-5076)は、ウェルあたり スの正規化など、エピトープビニング解析専用のソフトウェアを利用 40μLのサンプル量で測定可能です。 できます。Octet HTXおよびその他のOctetシステムの詳細について Octet HTXシステムは、Octetファミリーのどの機器よりも高いスルー は、 ForteBio Webサイトを参照してください。 プットと汎用性を備えており、クロス競合アッセイやスループットが 要求されるエピトープビニングアッセイのニーズに最適です。この装 ELISAおよびSPRに対する利点 置は最大96の相互作用を同時にモニターし、96ウェルマイクロプレー Octet HTXシステムは、表1にまとめられているように、ELISAおよび ト全体を2分という前例のない速度でラベルフリー解析を可能にしま SPRに比べて数々の魅力的な利点があります。Octet HTXシステム す。 は、競合するメソッドよりも大幅に高速で、クルードなマトリックス を測定でき、個別で独立した並列の相互作用を同時にニターでき、か つ操作が簡単です。 Octet HTX system ELISA SPR 標識された検出試薬 不要 必要 不要 すべてのステップのモニタリング 可能 不可能 可能 リアルタイムモニタリング 可能 不可能 可能 ランニング時間(32x32) 8 時間 24 時間 14 時間* クルードライセートの適合性 あり なし なし (ハイブリドーマ上清、ライセート) クルード、未精製のサンプルを使用し た場合、潜在的な詰まりの問題があり ます。 低親和性mAbの検出 可能 不可能 可能 相互作用の並列測定 個別で独立した並列の相互作用 個別の独立した相互作用を同時にモ 結合された流路は、複数の独立した 同時にモニターできます。 ニターできますが、スループットは 相互作用を同時にモニターする機能 低下します。より高いスループット を制限します。 のためには、複数の独立した相互作 用の分析数は制限されます。 サンプルの回収、再利用 可能 不可能 不可能 バイオセンサーの選択 様々なバイオセンサーを利用可 N/A バイオセンサーの選択に制限があり 能です。 ます。 再生 • バイオセンサーは安価であり、 • サンプルを再生成して再利用す • チップは高価であり、再生する必 再生できる場合があります。 ることはできません。 要があります。 • モノクローナル抗体ごとに異な • 各モノクローナル抗体の再生を調 る再生バッファーを調整できま 整することはできません(共通の す。 再生条件が必要です)。 汎用性 すべてのビニング形式に対応 in-tandemビニングのためにプレー すべてのビニング形式と互換性があ しています。 ト表面で抗原を捕捉すると、その ります。スループットが大幅に低下 コンフォメーションが歪む可能性 するため、in-tandemアッセイには があります。そのため、sandwich ほとんど使用されません。 および premixビニングにより適し ています。 その他の考慮事項 • 簡単な実験セットアップ • 試験者による膨大な時間が必要 • 経験豊富なユーザーが必要 • 最小限のユーザートレーニング • 最小限のユーザートレーニング • センサー再生条件の最適化が必要 • ハイスループット測定には自動 化が必要 表1: ELISAとSPRに対するOctet HTXシステムの利点 * 20チャネルSPRシステム 2
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クロス競合アッセイ/ビニングアッセイの開発 すべてのビニング形式において、モノクローナル抗体のパネルでアッ セイを実行する方法が2つあります。 3つの主要なビニングアッセイ形式があります:in-tandem, classical sandwich, premix (Reference 1) 。 1 抗原ローディング済み(in-tandem)または未ローディング 1 In-tandem format (図1 A):バイオセンサーに固相化された抗 (Classical sandwich または premix)バイオセンサーは、パネルか 原が、2つの競合する抗体に連続したステップで提示されます。飽和 らのモノクローナル抗体のセットで飽和され、ある一種類のモノク まで結合した一次抗体が二次抗体の結合を阻害しない場合、重複しな ローナル抗体がすべてのバイオセンサーの競合モノクローナル抗体と い異なるエピトープへの結合として示されます。しかしながら、抗原 して導入されます。 の固相化は、その構造コンフォメーションを歪め、いくつかのエピ または トープをマスク、またはいくつかの非ネイティブなエピトープを露出 させる場合があります。したがって、タグを使用したキャプチャーな 2 抗原ローディング済み(in-tandem)または未ローディング どの穏やかな方法を使用して抗原を固相化することをお勧めします。 (classical sandwich または premix)バイオセンサーはある一種類 のモノクローナル抗体で飽和し、モノクローナル抗体のセットが競合 2 Classical sandwich format (図1 B):最初の抗体をバイオセ するモノクローナル抗体として提示されます。 ンサーに固相化し、続いて抗原とインキュベートし、次に2番目の 抗体でサンドイッチします。classical sandwichビニングは、単 適切なアッセイ形式の選択 量体で均質な抗原にのみ適しています。多量体または不均一な抗原 は、それぞれ、抗原の複数のサブユニットまたは異なる亜集団に結 図2のフローチャートは、特定の抗原と抗体のパネルに適切なアッセ 合する二次抗体をもたらし、誤ったビニングプロファイルをもたら イ形式を決定する際のさまざまな要因の概要を示しています。図2で します (Reference 2) 。 は、各アッセイ形式についての考慮事項と、推奨される初期最適化方 法も強調表示されています。 3 Premix format (図1 C):抗原を大過剰モル濃度の二次抗体とイ ンキュベートして、プレミックスサンプルを形成します。続いてプレ IN-TANDEM アッセイ ミックスサンプルは、最初の抗体がロードされたバイオセンサーに提 示されます。Premixアッセイ形式は、他のビニング法で見られるあ in-tandemビニングでは、まず精製された抗原をバイオセンサーに固 いまいな応答を明確にするためによく使用されます。premixアッセ 相化し、次に飽和モノクローナル抗体(Ab1)を提示し、次に競合す イの欠点は、大量の試薬とパネル内の各抗体と抗原との相互作用のお るモノクローナル抗体(Ab2)を提示します。このフォーマットは、 およそのKD値情報が必要なことです。 精製モノクローナル抗体だけでなく、未精製モノクローナル抗体上清 のビニングにも適用できます。 ビニング結果を確認するには、アッセイ形式に関係なく双方向でビニ ングを実行する必要があります。さらに、ビニング結果を裏付けるた めに、複数のビニングアッセイ形式を実行することができます。 A In-tandem assay B Classical sandwich assay C Premix assay Biosensor Biosensor Biosensor 1 Ag 1 Coupled 1 Coupled mAb (Ab1) 2 mAb (Ab1) Saturating Ag 2 Ag 3 mAb (Ab1) 2 3 Ag Ag Competing Sandwiching mAb (Ab2) mAb (Ab2) Premixed mAb + Ag (Ab2+Ag) 図1:エピトープビニングアッセイの3つの形式。(A)In-tandemアッセイ:バイオセンサー上に抗原が固相化され、飽和モノクローナル抗体(Ab1)と競 合モノクローナル抗体(Ab2)がそれぞれ結合します。(B)Classical sandwichアッセイ:一つのモノクローナル抗体がバイオセンサー(Ab1)に固相化さ れ、このモノクローナル抗体を使用して抗原が捕捉され、2番目のサンドイッチモノクローナル抗体がテストされます(Ab2)。(C)Premixアッセイ:1つ のモノクローナル抗体をバイオセンサー(Ab1)に固相化し、センサーを抗原と大過剰モルの2番目のモノクローナル抗体(Ab2)を含むプレミックス溶液 にさらされます。 3
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適切なバイオセンサーの選択 ストレプトアビジンベースのアプローチ in-tandemビニング研究では、固相化抗原の構造と活性を維持するバ 抗原の特定の位置に1つのストレプトアビジン結合部位を導入するin イオセンサーを選択することが重要です。バイオセンサーのラインア vivo部位特異的ビオチン化法が推奨されます。ただし、必要に応じ ップについては、Biosensor Selection Guideを参照してください。 て、抗原のin vitroビオチン化を行うことができます。ストレプトアビ ジンバイオセンサーによるタンパク質リガンドの詳細なビオチン化プ ロトコルについては、Technical Note 28, Biotinylation of Protein for アフィニティタグベースのアプローチを使用するキャプチャー法 Immobilization onto Streptavidin Biosensors を参照してください。 キャプチャーバイオセンサーは、既知のモチーフまたはタグを介して ストレプトアビジンバイオセンサー(SA)は、固相化された抗原のレ 抗原に結合する高親和性キャプチャー抗体またはタンパク質が事前に ベルまで再生可能です。 固相化されています。タグまたはモチーフが特定の抗原位置で設計で きるため、キャプチャベースのアプローチでは、抗原の構造的歪みが 最も少ない、最も好ましい配向が可能になります。したがって、キャ アミン反応性カップリング(AR2G)ベースのアプローチ プチャベースのアプローチは、in-tandemビニング研究の抗原固相化 アミン反応性バイオセンサー(AR2G)を介して遊離のリジン残基と共 に適した方法です。抗原とバイオセンサーとの間の相互作用は、安定 有結合を形成することにより、抗原の直接固相化が確立されま しているべきであり、すなわち、解離が少ないかまたは最小限である す。AR2Gバイオセンサーは、キャプチャベースのアプローチまたは抗 べきです。タグ付き抗原に利用できるすぐに使えるバイオセンサーに 原のビオチン化が実行可能でない場合にのみ検討することをお勧めし は、Anti-GST、HIS2、Anti-Penta His、Anti-Human Fc ます。バイオセンサーへの抗原の共有結合は、その構造を歪める可能 Capture(AHC)、Anti-Mouse Fc Capture(AMC)およびNickel- 性があり、バイオセンサー表面が過度に飽和している場合、立体障害 NTA(NTA)があります。あるいは、抗原上の特定のモチーフまたは を引き起こす可能性があります。AR2Gバイオセンサーへの固相化のた タグに対する抗体をバイオセンサーに固相化することにより、カスタ めに、抗原をpH 4~6の10mM酢酸緩衝液で希釈してください。この方 ムバイオセンサーを作成することができます。最適化された再生プロ 法は通常、固相化されたリガンドのレベルまで再生可能です。AR2Gバ トコルが開発できれば、これらのバイオセンサーを再生および再利用 イオセンサー固相化の詳細なプロトコルについては、Technical Note して、アッセイコストを削減できます。 26, Dip and Read Amine Reactive Second-Generation (AR2G) Biosensors を参照してください。 Antigen Monomer Multimer mAbs mAbs Crude Crude (Hybridoma supes, (Hybridoma supes, Purified phage lysates) Purified phage lysates) Binning Binning Binning Binning format format format format Premix Classical sandwich In-tandem Classical sandwich In-tandem Premix In-tandem In-tandem PREMIX CLASSICAL SANDWICH IN-TANDEM • 抗原濃度はKD以上である必要があ • 抗原はバイオセンサーと結合した • 抗原はタグを使用して、または直 ります。 抗体から急速に解離してはいけま 接(AR2G)バイオセンサーに • プレミックス抗体は抗原よりも過 せん。 ロードできます。 剰である必要があります。 • AHC / AMCバイオセンサーを使用 • 「フリー抗原」が競合する抗体に • AHC / AMCバイオセンサーを使用 する場合、不飽和バイオセンサー 結合しないように、最初の抗体は ビニング形式に する場合、不飽和バイオセンサー 表面をブロックする必要がありま 飽和して抗原に結合したままであ おける考慮事項 表面をブロックする必要がありま す。 る必要があります す。 • バイオセンサーに結合された弱い • 飽和抗体として提示された弱い親 親和性/速い解離の抗体は、あいま 和性 / 速い解離の抗体はあいまい いなデータにつながる可能性があ なデータにつながる可能性があり ります ます。 • カイネティクススクリーニングか • 抗体間の交差反応がないことを確 • AR2Gバイオセンサーへの抗原の 推奨される らおおよそのKDを求める必要が 認します。 直接結合は、抗原の不活性化につ あります。 • SAまたはAR2Gへのカップリング ながる可能性があります。固相化 初期の最適化 • 抗体間の交差反応がないことを確 後に抗体に活性があることを確認 後に抗原に活性があることを確認 実験 認します。 します。 してください。 • SAまたはAR2Gへのカップリング • セルフブロッキングを確実にして • セルフブロッキングを確実にして 後に抗体に活性があることを確認 ください。 ください。 します。 • セルフブロッキングを確実にして ください。 図2:アッセイ形式のフローチャート。 4
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抗原ローディングまたは抗原固相化 バイオセンサーの選択、抗原濃度、およびローディング時間の最適化 バイオセンサーの最適な抗原ローディングは、良好なビニングデータ は、Octetシステムで1回のアッセイで、50、100、200 nMのいくつか の取得に重要です。 バイオセンサーを抗原で過飽和にしてシグナル の抗原濃度を10分間ロードし、その後バッファーで10分間解離するこ を最大化することは推奨されておらず、立体障害、センサー表面での とで同時に実行できます。図3は、Anti-Penta His(図3 A)およびNi- 凝集の可能性、または抗体と抗原間の非特異的相互作用により、デー NTA(図3 B)バイオセンサー上の100および200 nM の50 kDaヒス タのアーティファクトが発生する可能性があります。 チジンタグ付き抗原の10分間のローディングおよび解離ステップを示 しています。両方のバイオセンサーにおいて、2種類の濃度での抗原の 抗原ローディングステップを実施する場合、リガンドの固相化を迅速 ローディングカーブ特性と結合シグナル(nmシフト)が示されていま に行うよりも、ゆっくりとしたローディングを長時間行うことが望ま すが、いずれも許容範囲です。ただし15%以上の抗原がAnti-Penta しいです。ローディングカーブは、シグナルが0.5~1 nm程度まで Hisバイオセンサーから解離するようです(図3 A)。Ni-NTAバイオセ 徐々に増加する場合がありますが、抗原のサイズによっては、これよ ンサーへの100 nMの抗原ローディングは、かなりゆっくりとした初期 りも高い場合も低い場合もあります。抗原のバイオセンサーのロー 結合と10分後で約0.7 nmの最適ローディングシグナルを示し、解離は ディングには50~200 nMが典型的な濃度範囲です。重要なことは、 最小限で安定したままです(図3 Bの紫色のセンサーグラム); した 低い濃度で抗原をキャプチャーして、サンプルが密集することによる がって、この条件を後半の実験のための最適なローディング条件とし アーティファクトを最小限に抑えること、またバイオセンサーからの て選択しました。 抗原の解離が10分間に15%未満で安定していることです。抗原が飽 和および競合するモノクローナル抗体に浸された場合、抗原はバイオ バイオセンサーの水和 センサーに結合したままである必要があるため、アソシエーションに 進む前に、最小限のシグナルドリフトで安定したベースラインを確立 バイオセンサーは、アッセイを実行する前に、対応するサンプルの培 することが重要です。 地またはバッファーと水和を少なくとも10分間行う必要がありま す。in-tandemビニング中、バイオセンサーの水和は、ForteBio カイ ネティクスバッファー、PBS、または抗原を希釈するために使用され たバッファーで実行する必要があります。 A Anti-Penta HIS Biosensor 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0 200 400 600 800 1000 1200 Time (sec) B Nickel-NTA Biosensor 1.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 -0.1 0 200 400 600 800 1000 1200 Time (sec) 図3: 100および200 nMの50 kDa Hisタグ抗原の(A)Anti-Penta Hisおよび(B)Ni-NTAバイオセンサーへの抗原ローディングおよび解離。Anti-Penta Hisバイオセ ンサーは10分以内に表面からの抗原の有意な(> 15%)解離を示すのに対し、Ni-NTAセンサーは最小限の解離を示します。したがって、Ni-NTAバイオセンサーは この抗原の実験用センサーとして選択されました。 5 Binding (nm) Binding (nm)
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ベースライン このカイネティクススクリーニングでは、抗原のローディングに すべてのビニングアッセイでは、通常3つのベースラインステップが 続いて、200~350 nMのモノクローナル抗体と10~15分間結合 あります。in-tandemビニングにおける3つのベースラインステップ させ、その後10~15分の解離ステップを行います。このスク は、1)抗原ローディング前のステップ(センサーチェック)、2)飽 リーニングアッセイは、抗原に対する親和性が弱いモノクローナ 和モノクローナル抗体の結合前のステップ(Ab1)、および3)競合 ル抗体にフラグを付けるためにも使用できます。弱い親和性のモ するモノクローナル抗体(Ab2)のアソシエーション前のステップで ノクローナル抗体は、飽和モノクローナル抗体(Ab1)として使 す(図4)。ベースラインは、非特異的結合とバッファー効果からの 用された場合は信頼できる結果が得られません。それらは素早く ドリフトを軽減するために、後続のロードおよび2つのアソシエー 解離し、遊離の抗原エピトープが競合するモノクローナル抗体 ションステップで使用されるものと一致するバッファーまたはメディ (Ab2)に晒されます。このようなモノクローナル抗体サンプル アを使用して確立する必要があります。ベースラインのステップを実 は、競合するモノクローナル抗体(Ab2)として使用されるとよ 行することで、バイオセンサーから未結合の抗原とAb1を取り除くこ り信頼性が高くなります。図5は、6種類のモノクローナル抗体の とができます。 パネルのカイネティクススクリーニング結果を示しています。こ のパネルでは、抗体100、102、103は高いオフレートを示し、 モノクローナル抗体が細胞培養上清に存在する場合、モノクローナル in-tandemアッセイ形式で飽和モノクローナル抗体(Ab1)とし 抗体結合ステップの前のベースラインステップは、Mockトランス て使用すると、あいまいなビニングプロファイルが得られる場合 フェクトされた上清、使用済み培地、または成長培地に添加された低 があります。 IgG FBSで実行する必要があります。 ストレプトアビジンやNi-NTAな どの一部のバイオセンサーは、上清に存在する遊離ビオチンまたは無 関係のヒスチジン含有タンパク質によって非特異的結合を起こしやす アソシエーション い場合があります。これらの場合、使用済みまたはFBS補充培地で2 in-tandemビニングアッセイには2つのアソシエーションス ~5分ベースラインを実行することが重要になります。 テップがあります。一つは飽和モノクローナル抗体(Ab1)の抗 原結合バイオセンサーへの結合で、もう一つは競合するモノク 精製モノクローナル抗体でビニングを行う場合、モノクローナル抗体 ローナル抗体(Ab2)のAb1の存在下での抗原への結合です(図 の結合の前のベースラインステップは、モノクローナル抗体を希釈し 1 A)。最初の結合ステップは、センサーグラムの曲線を確認す たのと同じバッファー(ForteBio カイネティクスバッファーまたは るのに十分な時間、また結合曲線が十分平坦化するまで測定す PBS)で行う必要があります。精製モノクローナル抗体をビニングす る必要があります。曲線の平坦化は、Ab1がバイオセンサーに固 る場合、典型的には非特異的結合は最小限になります。ただし、非特 相化された抗原を飽和させたことを示しています。一般に10~ 異的結合が観察された場合は、BSAなどのブロッキング試薬(最大1 15分程のAb1アソシエーションステップが推奨されます。競合す ~2%)やTween-20などの非イオン性界面活性剤(最大 0.05%)を る抗体(Ab2)のアソシエーションも、センサーグラムのいくつ バッファーに追加してください。 かの曲線を確認するのに十分な時間実行する必要があります。 ただし、Ab2結合曲線は必ずしも平衡に達する必要はありませ 抗原に活性があることの確認 ん。Ab2結合ステップでは、5~10分の結合で十分です。 バイオセンサー表面への抗原の結合は、時折、抗原の構造的コンフォ メーションを変化させ、ネイティブではないエピトープやマスキン グされたエピトープが露出される可能性があります。ビニング研究 に進む前に、抗原が活性状態であり、モノクローナル抗体パネルに 結合できることを確認することが重要です。抗原活性は、ビニング アッセイと同じ形式で実行されるカイネティクスアッセイで確認で きます。 Baseline Baseline Baseline Antigen Saturating mAb (Ab1) Competing mAb (Ab2) 4.0 3.0 2.0 1.0 0 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 Time (sec) 図4:In-tandemビニングアッセイの代表的なデータ。矢印はこのアッセイ形式の3つのベースラインを示し、抗原のロード前(センサーチェック)、抗原の ロード後・飽和モノクローナル抗体の結合前(Ab1)、競合するモノクローナル抗体の結合前(Ab2)に設定します。ベースラインのステップでは、未 結合の抗原/抗体をバイオセンサーから取り除きます。Ab1結合後のベースラインを使用して、オフレートが速いモノクローナル抗体にフラグを付ける こともできます。 6 Binding (nm)
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Ab 100 AB 101 Ab 102 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0 250 500 750 1000 0 250 500 750 1000 0 250 500 750 1000 Time (sec) Time (sec) Time (sec) Ab 103 Ab 104 Ab 105 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0 0 250 500 750 1000 0 250 500 750 1000 0 250 500 750 1000 Time (sec) Time (sec) Time (sec) 図5:Ni-NTAバイオセンサー上の固定化抗原と相互作用する6種類のモノクローナル抗体のパネルの結合カイネティクス。すべてのモノクローナル抗体が結合を示 し、固定化時に抗原がその活性を保持することが確認されます。抗体100、102、および103はオフレートが高く、タンデムビニング形式で飽和モノクローナル抗 体(Ab1)として使用すると、ビニングプロファイルがあいまいになる可能性があります。 完全なセルフブロッキングの確認 Classical sandwichアッセイおよびPremixアッ ビニングアッセイを測定するのに先立って、セルフブロッキングを セイ 確実にするために、Ab1とAb2の濃度を最適化する必要があります。 セルフブロッキングとは、飽和抗体と競合抗体の両方に同じ抗体を これらのビニング形式のいくつかの側面は類似しているた 使用する測定手法です。抗体がバイオセンサー上の抗原をAb1で完全 め、classical sandwich および premixビニングアッセイのアッセイ開 に飽和させた場合、Ab2の結合シグナルはゼロになります。一般的 発に関する議論をここにまとめました。2つの形式間の違いは強調表 に、完全なセルフブロッキングを確実にするために、Ab1とAb2は最 示され、詳細に説明しています。 適化中に100~400 nM程度の範囲の同じ濃度でテストされます。た classical sandwichアッセイでは、Ab1をバイオセンサーに固相化した だし、実際のビニングアッセイでは、試薬を節約するために、Ab2の 後、抗原とサンドイッチAb2を段階的に結合します。Ab2分子は、Ab2 濃度をAb1の濃度の半分から3分の1でテストする場合があります。 結合エピトープが固相化されたAb1のエピトープと重複しない場合に 図6 Aは、パネル内の14種類の精製モノクローナル抗体のセルフブ のみ、捕捉された抗原に結合できます。classical sandwichビニング ロッキング曲線を示しています。飽和および競合モノクローナル抗 フォーマットは、モノクローナル抗体上清および精製モノクローナル 体として使用した抗体濃度は250 nMでした。飽和モノクローナル抗 抗体に適用可能です。classical sandwich形式の1つの制約は、一価の 体と競合モノクローナル抗体のアソシエーションステップの時間 抗原で、かつ均一な抗原混合物を必要とすることです。抗原が多量体 は、それぞれ15分と10分でした。すべてのAb2シグナルは最小限で または凝集体を形成すると、結果が偽陽性となる可能性があります。 あり、有意なセルフバインディングはないことを示しています。よ この場合、固相化されたモノクローナル抗体は抗原を飽和させず、遊 り明確な画像を得るために、すべてのモノクローナル抗体を整列さ 離の抗原エピトープがモノクローナル抗体(Ab2)結合のサンドイッ せたAb2結合トレースを図6 Bに示します。約0.1 nmのセルフバイン チに利用されます。 ディングシグナルが赤、黄、緑、濃い青、黒、水色のトレースで観 premixアッセイでは、Ab1がバイオセンサーに固相化されます。 固相 察されました(図6 B)。小さなセルフバインディングシグナルは、 化後に続いて、Ab1は、4~5時間ほど事前にインキュベートされた抗 抗原を固相化したバイオセンサーがAb1によって完全に飽和していな 原-Ab2複合体に結合します。最初のプレミックスを実行するには大量 い可能性が高く、Ab2結合に利用可能ないくつかの遊離のエピトープ のAb2が必要なため、premixビニングアッセイは通常、上清ではなく が残っています。バイオセンサー上の抗原を完全に飽和させ、完全 精製されたサンプルに対して実行されます。このアッセイ形式は、一 なセルフブロッキングを可能にするには、より高濃度の飽和モノク 価および多価の抗原に対応し、多くの場合、あいまいなビニングプロ ローナル抗体が必要になる場合があります。したがって、これらの6 ファイル、または他のエピトープビニング形式で得られる「中間」的 種類の抗体は、競合するモノクローナル抗体を250 nMに維持しなが な応答の確認に最適な形式です (Reference 1, 2) 。 ら、高濃度の飽和モノクローナル抗体(333.3 nM)を使用して再テ ストされました(図6 C)。図6 Cに見られるように、高濃度の飽和 mAbの使用は、6種類のすべてのモノクローナル抗体のセルフバイン ディングを減少させました。その結果、in-tandemビニング実験を 実行する最終条件として、333.3 nMの飽和モノクローナル抗体 (Ab1)による15分間のアソシエーション、および250 nMの競合モ ノクローナル抗体(Ab2)による10分間のアソシエーションを最終 条件として選択しました(図4)。 7 Binding (nm) Binding (nm) Binding (nm) Binding (nm) Binding (nm) Binding (nm)
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A Competing 適切なバイオセンサーの選択 Antigen Saturating mAb (Ab1) mAb (Ab2) Anti-Human Fc Capture (AHC) またはAnti-Mouse Fc Capture (AMC) バ 3.5 イオセンサーなどのすぐに使用できるバイオセンサーは、精製モノク 3.0 ローナル抗体や細胞培養上清モノクローナル抗体をキャプチャーする ために利用できます。 モノクローナル抗体の不可逆的な固相化が必要 2.5 な場合は、アミン反応性(AR2G)およびストレプトアビジン(SA) バイオセンサーも利用できます。バイオセンサーのラインアップにつ 2.0 いては、Biosensor Selection Guideを参照してください。 1.5 アミン反応性カップリング(AR2G)ベースのアプローチ 1.0 第一級アミン含有モノクローナル抗体のAR2Gバイオセンサー表面への 0.5 共有固相は、安定したアミド結合を介して可能になります。このカッ プリング法はほとんどの精製モノクローナル抗体に適用できますが、 0 上清中の抗体には使用できません。このアプローチは、 classical 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 sandwich または premixビニングアッセイを実行する場合によく使用 Time (sec) されますが、モノクローナル抗体とバイオセンサーの共有結合によ B り、抗体の構造が歪み、活性が低下する場合があります。 Octet HTX Competing mAb (Ab2) システムでAR2Gバイオセンサーを使用する利点の一つは、個別のバイ オセンサーが互いにリンクされていないため、モノクローナル抗体の 0.25 さまざまなパネルに対して臨機応変にさまざまな実験由来の96種類の 0.20 モノクローナル抗体コーティングバイオセンサーの調整が可能になる 0.15 ことです。抗体結合AR2Gバイオセンサーは通常、固相化されたモノク 0.10 ローナル抗体のレベルで再生可能です。AR2Gバイオセンサー固相化の 0.05 詳細なプロトコルについては、Technical Note 26, Dip and Read 0 Amine Reactive Second-Generation (AR2G) Biosensors を参照してく -0.05 ださい。 -0.10 -0.15 キャプチャーベースのアプローチ -0.20 キャプチャーバイオセンサーは、Anti-Human Fc Capture (AHC)や -0.25 Anti-Mouse Fc Capture(AMC)バイオセンサーなどの高親和性キャプ 4850 4900 4950 5000 5050 5100 チャー抗体があらかじめ固相化されています。これらのバイオセン Time (sec) サーはFc領域を介してモノクローナル抗体に結合し、バイオセンサー 表面でモノクローナル抗体の好ましい配向を可能にします。Protein C Competing mAb (Ab2) A、Protein G、Protein Lバイオセンサーは、非ヒトおよび非マウス抗 体を固相化するためにも利用できます。AHC、AMC、Protein 0.25 A、Protein G、Protein Lバイオセンサーを使用する場合、最初のモノ 0.20 クローナル抗体の固相化に続いて、バイオセンサー表面を完全にブ 0.15 ロックすることが不可欠です。バイオセンサー表面の残りのブロック 0.10 されていないサイトは、サンドイッチ抗体(Ab2)に直接結合し、偽 0.05 陽性のビニング結果をもたらす可能性があります。 0 タグ付きモノクローナル抗体の場合、Anti-GST(GST)、Anti-Penta -0.05 His(HIS)、Ni-NTA(NTA)も使用できます。クルードな培養上清中 -0.10 のモノクローナル抗体がヒスチジンタグ化されている場合、Anti-HIS -0.15 はNi-NTAより優れた結果をもたらす可能性があります。なぜなら、Ni- -0.20 NTAは上清由来のHisタグタンパク質と非特異的結合を起こす可能性が -0.25 あるからです。非特異的結合は、ベースラインステップのバッファー -0.30 組成を最適化することで軽減できます。これについては、次のベース 1750 1800 1850 1900 1950 2000 ラインセクションで詳しく説明します。すべてのキャプチャーベース Time (sec) のバイオセンサーは、再生して複数回再利用できるため、アッセイの コストを削減できます。 図6:in-tandemビニング形式での14種類の精製モノクローナル抗体のセルフ ブロッキング曲線。(A)250 nMで飽和または競合モノクローナル抗体として 提示されたすべての抗体の非整列データ。(B)(A)からのデータを競合モノ クローナル抗体(Ab2)結合のみを示すようにトリミングし、Ab2ステップの 開始に合わせて整列しました:6種類の モノクローナル抗体はわずかな自己結 合を示します(C)(B)でいくつかの自己結合を示した6 種類のモノクローナ ル抗体の再テストからのデータ。飽和(Ab1)および競合モノクローナル抗体 (Ab2)ステップにはそれぞれ333.33 nMおよび250 nM濃度を使用し、競合モ ノクローナル抗体のみのデータを示しました。 Ab1とAb2の濃度を変更するこ とにより、これらの6種類のモノクローナル抗体で完全なセルフブロッキング が達成されました。 8 Binding (nm) Binding (nm) Binding (nm)
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ストレプトアビジンベースのアプローチ バイオセンサーの水和 I抗体が非ヒト、非マウスで、タグ付けもされていない場合、キャプ バイオセンサーの水和は、対応するサンプルと一致する培地または チャーベースのアプローチは使用できません。この状況は、ハムス バッファー中で少なくとも10分間行う必要があります。ハイブリドー ター、ウサギ、ヤギ、ヒツジの抗体を扱うときによく起こります。こ マ上清やファージライセートなどの複雑なサンプルの場合、バイオセ のような場合、抗体をビオチン化し、ストレプトアビジンバイオセン ンサーの水和はより長い時間(約30分から1時間)行うことをお勧めし サーを使用して固相化することが可能です。ストレプトアビジン-ビオ ます。精製モノクローナル抗体を用いたクclassical sandwich および チン相互作用は迅速で安定しています。これらのバイオセンサーは、 premixビニングでは、バイオセンサーの水和は、通常はForteBio カイ 固相化されたモノクローナル抗体のレベルで再生できます。ストレプ ネティクスバッファーまたはPBSなどのモノクローナル抗体の希釈に トアビジンバイオセンサーで使用するタンパク質リガンドのビオチン 使用したバッファーで行う必要があります。モノクローナル抗体上清 化の詳細なプロトコルについては、Technical Note 28, Biotinylation でビニングを行う場合は、Mockトランスフェクトした上清、使用済み of Protein for Immobilization onto Streptavidin Biosensors を参照し 培地、または増殖培地に添加された低IgG FBSで水和を行う必要があり てください。 ます。 抗体のローディングまたは抗体の固相化 ベースライン モノクローナル抗体のローディングステップを実行するときは、ロー Classical sandwichビニングには、3つのベースラインステップがあり ディングが不均一になる可能性がある急速なモノクローナル抗体固相 ます。1)モノクローナル抗体をローディングする前のステップ(セン 化よりも、ゆっくりとした長時間のローディングが推奨されます。 サーチェック)、2)抗原のアソシエーション前のステッ ローディング曲線は徐々に増加するシグナルを示し、ほとんどのモノ プ、3)サンドイッチモノクローナル抗体のアソシエーション前のス クローナル抗体で0.5‒1 nmに達するはずです。50‒200 nM程度のモノ テップ。premixビニングには2つのベースラインステップがありま クローナル抗体濃度ならば、AHC、AMC、SA、およびAR2Gバイオセ す。1)モノクローナル抗体固相化前のステップ(センサーチェック) ンサーの固相化に典型的に適用することができます。 および2)複合体の結合前のステップ(抗原とサンドイッチモノクロー SAまたはAR2Gバイオセンサー上のモノクローナル抗体固相化は、ス ナル抗体の複合体)。 トレプトアビジン-ビオチン、ならびに遊離リジン残基のアミノ基との ベースラインは、次のローディングまたはアソシエーションステップ 間の効果的な不可逆的な相互作用により、それぞれ安定しています。 で使用されるものと一致するバッファーまたは培地で実行されます。 したがって、ロード後のベースラインは安定しているはずです。 バイオセンサーから未結合のモノクローナル抗体と抗原を取り除き、 AHCやAMCなどのキャプチャベースのバイオセンサーを使用する場 非特異的結合を最小限に抑え、バッファー効果によるドリフトを減ら 合、初期の結合曲線は飽和に達するはずです。バイオセンサーのロー すために、ベースラインステップが実行されます。 ディング後に未結合の結合部位が残っていないことを確認するには、 上清でビニングを行う場合:抗原アソシエーション前のベースライン モノクローナル抗体ローディングに続くブロッキングステップを常に モテップと、Ab2アソシエーション前の別のベースラインは、どちらも 実行する必要があります。一般的なルールとして、すべてのモノク 後続のアソシエーションステップと一致するマトリックスを使用しま ローナル抗体が同じアイソタイプである場合、同じアイソタイプで無 す。このアプローチは、大きな屈折率のミスマッチから起こりうるシ 関係の抗体 を50 µg/mLで5~10分間ブロッキングすることで十分だ グナルのジャンプやドリフトを最小限に抑え、上清中のタンパク質か と考えられます。ブロッキングステップの後に2~4分の洗浄を行っ らの非特異的結合を緩和します。ベースラインステップは、Mockトラ て、抗原アソシエーションの前に緩く結合した抗体を確実に取り除 セスフェクトされた上清、使用済み培地、または低IgG FBSを添加した く必要があります。バイオセンサーを同じ抗体ウェルに戻すことで、 培地を使用して2~5分間ほどで実行できます。 セルフバインディングが観察されないことを確認する必要がありま ビニング実験が精製モノクローナル抗体で実行される場合:各アソシ す。もしパネルのモノクローナル抗体のアイソタイプが異なるか不明 エーションステップの前のベースラインステップでは、ForteBio カイ な場合は、50 µg/mLのポリクローナル抗体で10分間ブロッキングし ネティクスバッファーやPBSなどの適切なモノクローナル抗体や抗原 た後、2~4分間バッファーで洗浄する方法が役立つ場合がありま 希釈バッファーを使用する必要があります。精製モノクローナル抗体 す。特にポリクローナル抗体がサンドイッチ型モノクローナル抗体ア でビニングする場合、非特異的結合はごくわずかです。ただし、非特 イソタイプを代表していない場合は、ブロッキングステップをより長 異的結合が観察される場合は、BSA(最大1~2%)などのブロッキン くすることも役立ちます。 グ試薬やTween-20(最大0.05%)などの非イオン性界面活性剤を追加 Ab1は抗原とサンドイッチ抗体に浸された場合でも、バイオセンサー することができます。 に結合したままである必要があるため、モノクローナル抗体固相化後 classical sandwich または premixビニングアッセイにおいてAR2Gバ の安定したベースラインと最小限のシグナルドリフトを確立してから イオセンサーを使用してモノクローナル抗体を固相化する場合、ロー 次のアソシエーションステップに進む必要があります。 ディングの前後の短いベースラインステップはH2O中で行う必要があ ります。ローディング後の30秒のH2Oステップの後に、抗原と同じ バッファーで5~10分のベースラインステップを実行する必要があり ます。H2Oステップは、プロトコルの最初のH2Oベースラインステッ プに対してバイオセンサーへのモノクローナル抗体のローディングを 計算するために必要です。 9
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モノクローナル抗体に活性があることの確認 Premix AHC、AMC、Protein A、G、またはLのバイオセンサーを使用してキャ premixビニングアッセイを実行するには、カイネティクス解析から計 プチャベースのアプローチでAb1をロードする場合、モノクローナル 算された各モノクローナル抗体および抗原の推定親和性定数が必要で 抗体の活性を確認する必要はありません。一方、SAまたはAR2Gバイ す。抗原抗体複合体が固相化抗体(Ab1)に結合できるかどうかを確認 オセンサーをモノクローナル抗体カップリングに使用する場合は、 するには、あらかじめ混合したモノクローナル抗体(Ab2)の濃度を AR2Gで使用される低pHの酢酸緩衝液などの過酷な条件にさらされる KD値の約10倍用意する必要があります。カイネティクススクリー と抗体の構造が歪む可能性があるため、活性を検証することが重要で ニングは、133.33 nMの各モノクローナル抗体をAR2Gバイオセンサー す。結合の弱いモノクローナル抗体にフラグを付け、すべてのモノク にロードし、続いて100 nMの抗原を15分間ずつアソシエーションおよ ローナル抗体と抗原のおおよその親和性値(KD)を取得するため、ビ びディソシエーションさせることで実行できます。たとえば、図7に示 ニング形式でのカイネティクススクリーニングをお勧めします。 すパネルの14種類のモノクローナル抗体では、最も高いKD値は30.9 classical sandwichアッセイでは、抗原がサンドイッチ型モ ノクロー nMでした(データは示していません)。したがって、30 nMの抗原と ナル抗体(Ab2)の結合前にバイオセンサーから著しく解離する可能 300 nMの各モノクローナル抗体をプレインキュベーション、もしくは 性があるため、弱い親和性のモノクローナル抗体のバイオセンサー表 プレミックスし使用されました。プレミックスでは室温で4~5時間ま 面への固相化はあまり適していません。 たは4℃で一晩インキュベートされます。 モノクローナル抗体固相化後、50~200 nMの抗原を5~15分間結合さ premixビニングの研究では、アソシエーションステップは1つだけ、 せ、その後5~15分間解離させます。 すなわち抗原とサンドイッチモノクローナル抗体を含む、複合体の結 合です。アソシエーションは10~15分間実行し、データトレースが曲 アソシエーション がってくることを示す必要があります。図8に示すように、抗原のみの コントロールと固相化モノクローナル抗体に結合しないプレミックス Classical sandwich 複合体の間に明確な違いがあるはずです。固相化抗体に結合しない抗 Classical sandwichアッセイには、モノクローナル抗体のローディン 原抗体複合体の応答は最小限です。一方、固相化抗体に結合する抗原 グに続く2つのアソシエーションステップが含まれます。1)抗原結 抗体複合体のプレミックス応答は、複合体が抗原のみの応答よりも高 合、および2)サンドイッチモノクローナル抗体(Ab2)のアソシエー くなります。固相化されたモノクローナル抗体に結合する抗原抗体複 ションです。抗原アソシエーションステップを5~15分間実行する 合体の応答は、抗原と追加の抗体で構成されるためにバイオセンサー と、データトレースの曲線を確認でき、ステップの終わりに向かって 表面での質量が増加し、大きくなります。固相化抗体に結合しない抗 曲線が平衡になるはずです。サンドイッチモノクローナル抗体結合ス 原抗体複合体の応答は最小限です。これは、プレインキュベーション テップが約5~10分実行すると、データトレースの曲線を確認できる ステップ中に抗原がAb2と完全に複合体化され、バイオセンサー上の固 と考えられます。ただし、結合曲線は平衡に達する必要はありませ 相化モノクローナル抗体に結合できる遊離の抗原が残っていないため ん。 です。 完全なセルフブロッキングの確認 抗体間の交差反応性 サンドイッチアッセイを実行する前に、完全なセルフブロッキングを モノクローナル抗体間の交差反応は、premix および classical 確実にするために、抗原とAb2の濃度を最適化する必要があります。 sandwichビニング形式で起こる可能性があります。これらのアーティ 同じモノクローナル抗体をバイオセンサーへの固相化とサンドイッチ ファクトは、ファンデルワールス力、疎水性結合または親水性結合な (Ab2)に使用した場合、Ab2の結合シグナルは、両方の抗体が同じエ どの弱い相互作用の組み合わせから発生する可能性があり、誤ったポ ピトープに結合するため、非常に低いかゼロでなければなりません。 ジティブサンドイッチペアをもたらす可能性があります。サンドイッ チモノクローナル抗体からの結合シグナルが抗原依存性のみであるこ 注:抗原が一価ではない場合、抗原混合物が不均一である場合、また とを確認することが重要です。これは、抗原の非存在下でパネル内の は抗体が凝集する傾向が高い場合、セルフバインディングはclassical すべてのモノクローナル抗体への固相化モノクローナル抗体の結合 sandwichビニングでも観察されます。 をスクリーニングすることで確認できます。図9に示すように、パネル アッセイの最適化中、Ab1とAb2は同じ濃度(100~350 nMの範囲)で 内のどのモノクローナル抗体も交差反応性の結合を示しませんでし テストされ、セルフバインディングがシグナルを生成しないことを確 た。これは、サンドイッチモノクローナル抗体(Ab2)を使用したビ 認します。アソシエーションにおける抗原の推奨濃度は約50~200 nM ニングアッセイで観察された結合シグナルは、抗原依存性のみである です。 ことを示しています。 図7 Aは、classical sandwichビニング形式での14種類の精製モノク ローナル抗体のセルフブロッキング曲線を示しています。AR2Gバイオ センサーを使用して、モノクローナル抗体を133.33 nMで固相化した 後、75 nMの抗原と133.33 nMのサンドイッチモノクローナル抗体とア ソシエーションさせました。モノクローナル抗体カップリングステッ プは10分間(図には示されていません)、その後、抗原とセルフサン ドイッチモノクローナル抗体のアソシエーションをそれぞれ5分間実行 しました(図7 A)。Ab2シグナルは有意なセルフバインディングを示 しませんでした。すべてのモノクローナル抗体のAb2結合トレースを 図7 Bに示します。いずれもセルフバインディングがないことを示して います。 10
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A Antigen Sandwiching mAb (Ab2) バイオセンサーの再生 ForteBioのDip and Readバイオセンサーは、費用対効果が高く使い捨 0.6 ても可能です。加えて複数回再生し再利用できるため、アッセイコス トをさらに節約できます。ほとんどのバイオセンサーの再生に関する 0.5 ガイドラインは、それぞれのテクニカルノートに記載されています。 0.4 ただし、結合相互作用を効果的に引きはがす条件はタンパク質に依存 し、実験で検証する必要があります。 再生条件の最適化に関する詳細 0.3 情報は、Application Note 14, Biomolecular Binding Kinetics Assays on the Octet Platform に記載されています。 0.2 Octetプラットフォームは、バイオセンサーの自動再生を可能にする 0.1 複数のツールを提供します。事前設定されたソフトウェアのテンプ レートは、アッセイに再生を組み込んでおり、再生条件を含んだ効率 0 的なスクリーニング用のテンプレートも利用できます。Dip and Read 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 方式では、再生条件を個々のモノクローナル抗体のニーズに合わせて Time (sec) 調整できるため、すべてのモノクローナル抗体で機能しない可能性が ある単一のソリューションを使用する必要がなく、実験内にさまざま B Sandwiching mAb (Ab2) な再生ソリューションを組み込むことができます。これにより、単一 の再生ソリューションよりも多くのアクティブな結合モノクローナル 0.20 抗体が維持されるため、モノクローナル抗体の消耗が低下し、これら 0.15 のモノクローナル抗体結合バイオセンサーをより多くの実験で使用で 0.10 きるようになります (Reference 3) 。 0.05 再生を成功させるには、次の条件を満たす必要があります。 0 • バイオセンサー表面の化学的性質は、再生条件下で安定している必 -0.05 要があります。 -0.10 •固相化されたリガンド-アナライトタンパク質相互作用は、再生中に -0.15 完全に解離する必要があります。 -0.20 •固相化されたリガンドは安定していて、複数の再生サイクルにわたっ -0.25 1250 1300 1350 1400 1450 1500 て活性を保持する必要があります。 Time (sec) 図7:Classical sandwich形式での14種類の精製モノクローナル抗体の SAおよびAR2Gバイオセンサーは、再生条件下で結合した検体を除去 セルフブロッキング曲線。(A)すべての抗体からの非整列データ: Ab1をセンサーに結合し(ステップは示していません)、続けて75 nM することにより、固相化されたリガンドレベルで再生できます。 特定 の抗原結合と133.33 nMのサンドイッチモノクローナル抗体(Ab2)を のリガンド-アナライトタンパク質ペアの適切な再生プロトコルは、実 結合させました。(B)サンドイッチモノクローナル抗体(Ab2)ス 験で決定する必要があります。ほとんどの抗体-タンパク質相互作用 テップのみを表示するようにトリミングされた(A)のデータ:すべて は、10 mMグリシン(pH 2‒3)などの低pHバッファー(pH 2‒4)で のモノクローナル抗体で完全なセルフブロッキングが観察されます。 の一連の短いインキュベーションによって切断され、その後アッセイ バッファーで中和することによって再生が可能です。 Antigen+Ab2 Premix response for 図10は、再生条件のテストを示しています。モノクローナル抗体を固 antigen-antibody 1.0 相化するためにAR2Gバイオセンサーが使用され、その後、Classical complexes that can bind to immobilized sandwichアッセイで抗原とサンドイッチモノクローナル抗体が順次 mAb 結合しました。10 mMグリシンpH 2.5とアッセイバッファーを交互に 5秒間インキュベートする再生により、7サイクルテストしました。 AR2Gバイオセンサーは、固相化されたモノクローナル抗体のレベル 0.5 Antigen-only response まで再生されたため、抗原結合と自己サンドイッチモノクローナル抗 体のシグナルのみが検証されました。固相化されたすべての抗体は、 Premix response for antigen-antibody 過酷な再生条件を許容し、最大7回の再生サイクルの間、それらの抗 complexes that 原結合を保持しているように見えました。 0 cannot bind to immobilized mAb 0 200 400 600 800 1000 Time (sec) 図8:バイオセンサー(Ab1)に結合された単一のモノクローナル抗体に対し てテストされた大きなパネルからの14 種類のモノクローナル抗体の代表的な premixビニングデータ。プレミックス混合物(30 nM抗原および300 nM mAb2)の結合のアソシエーシステップのみが、抗原のみのコントロールと ともに示されています。固相化抗体に結合できる抗原抗体複合体の応答は、 抗原のみの応答よりも高く、固相化抗体に結合できない抗原抗体複合体の応 答は最小限です。 11 Binding (nm) Binding (nm) Binding (nm)
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Sandwiching mAb (Ab2) Octetシステムでアッセイをセットアップするための一般的なワークフ 0.20 ローには、次の主要なステップが含まれます。 1 バッファー、再生バッファー、抗原および抗体溶液を準備します。 0.15 2 バイオセンサー水和プレートを準備します。水和バッファーは、アッ セイバッファーと可能な限り一致させてください。 0.10 3 リードヘッドを設定します(すなわち、何列のバイオセンサーを同時 に分析するか決定します)。Octet HTXシステムでは、8, 16, 32, 48, 96 0.05 チャネルの選択が可能です。 4 Octet Data Acquisition ソフトウェアでプレートのレイアウト、アッ 0 セイ手順を決定し、バイオセンサーの割り当てを行います。 5 上記で定義したプレートレイアウトに基づいて、アッセイプレートを -0.05 準備します。対応するウェルにバッファー、抗体、抗原、および再生溶 液を入れます。 0 100 200 300 400 500 Time (sec) 6 バイオセンサーを水和プレートに配置し、アッセイプレートをOctet 図9:Classical sandwich形式で抗原の非存在下で互いにテストされた14 種類 本体のプレートステーションに10分間置きます。これにより、バイオセ のモノクローナル抗体のパネルの代表的なデータ。このパネルでは、モノク ンサーの完全な水和が可能になり、アッセイプレートが均一なアッセイ ローナル抗体間の交差反応性は観察されませんでした。 温度に確実に達することになります。 7 アッセイを実行します。 AMC、FLAG、Ni-NTA、AHCなどのキャプチャベースのバイオセン 8 データ処理と分析を実行します。 サーの場合、表面を固相化前の状態まで再生できます。固相化された リガンドと続いて結合した分子は、10 mMグリシン(pH 1‒2)での5 Octet Data Acquisition ソフトウェアには、新しいエピトープビニング 秒間のインキュベーションとそれに続くアッセイバッファーでの5秒 アッセイを設定するための事前に構成された3つのテンプレートがありま 間のインキュベーションを交互に3~5サイクル実行することにより、 す。図12に示すように、使用可能な3つのテンプレートは次の通りで 再生中に除去されます。 す。 図11では、Ni-NTAバイオセンサーを使用してHISタグ付きリガンドを • 96ウェルプレートで8チャネルモードの7x7 classical sandwich 固相化した後、in-tandemアッセイで飽和モノクローナル抗体と競合 アッセイ(任意のOctet) モノクローナル抗体を結合しました。10 mMグリシンpH 1.5とアッセ • 96ウェルプレートの8チャネルモードでの7x7 in-tandemアッセイ(任 イバッファーの交互に5秒のインキュベーションを3サイクル行った 意のOctet) 後、ニッケルを再充填しました。図11に見られるように、抗原ロー ディングシグナルおよび両方の抗体の結合は、再生サイクルの影響を • 384ウェルプレートで32チャネルモードの32x32 in-tandemアッセイ ほとんど受けません。 用の2つのメソッドファイル(Octet HTXのみ) 典型的なエピトープビニングアッセイは、以下のステップを順番に使用 クロス競合/エピトープビニングアッセイの します。 実行 1 ベースラインまたはセンサーチェック Octet Data Acquisition ソフトウェアを使用すると、エピトープビニ 2 ローディング(アッセイフォーマットに応じて抗原または抗体の ングまたはクロス競合アッセイのセットアップがシンプルで直感的に いずれか—下記の注:を参照) 可能です。Octetシステムは、柔軟なアッセイデザインを提供し、エ 3 2番目のベースライン ピトープビニング形式と使用機器に応じた多くのオプションを提供し ます。エピトープビニングアッセイは、カイネティクスアッセイの一 4 アソシエーション 種であるため、「New Experiment Wizard」から「Kinetics」を選択 5 3番目のベースライン する必要があります。アッセイの設定に関する詳細な説明は、Data 6 アソシエーション Acquisition ソフトウェアのヘルプセクションにある「Octet Data Acquisition Software User Guide (バージョン 8.0 以降)」の「Kinetic 7 ディソシエーション(オプション) Experiments: Octet HTX」の章の「Epitope Binning」セクションに 注:プロテインA、G、L、AMC、またはAHCバイオセンサーがClassical あります。 sandwichおよびPremixアッセイで使用されている場合、バイオセン サーの表面が固相化抗体で完全に飽和させるのを確実にするために、 ローディングステップの後に5分以上ブロッキングステップを追加する 必要があります。 12 Binding (nm)
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I II III IV V VI VII Ag Ab2 Ag Ab2 Ag Ab2 Ag Ab2 Ag Ab2 Ag Ab2 Ag Ab2 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Time (sec) 図10:AR2Gバイオセンサーに結合させたモノクローナル抗体の再生テストのデータ。すべてのモノクローナル抗体をAR2Gセンサーに固相化させた後、 classical sandwich形式で抗原およびサンドイッチモノクローナル抗体(Ab2)を結合させました。10 mMグリシン pH 2.5とアッセイバッファーの5秒のインキュ ベーションを交互に行う再生を7サイクルをテストしました。抗原とサンドイッチモノクローナル抗体(Ab2)のアソシエーションシグナルは、サイクル間で影響を 受けなかったため、この再生条件が適切であることが確認されました。 I II III 3.5 Recharging Antigen Ab1 Ab2 Recharging Antigen Ab1 Ab2 Recharging Antigen Ab1 Ab2 3.0 nickel nickel nickel 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 -0.5 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000 9500 10000 Time (sec) 図11:Ni-NTAバイオセンサーの再生テストのデータ。HISタグ付き抗原をバイオセンサーに固相化し、続いて飽和(Ab1)および競合(Ab2)モノクローナル抗体を in-tandem形式で結合しました。10 mMグリシン pH 2.5とアッセイバッファーを交互に5秒インキュベートした後、ニッケルで再充填するテストを3サイクル行いま した。抗原ローディングのシグナルおよび両方の抗体の結合は、3回の再生サイクルの影響をほとんど受けません。 13 Binding (nm) Binding (nm)
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実際のビニングアッセイの前に別の実験を行い、抗体をAR2Gバイオ CLASSICAL SANDWICH センサー(classical sandwichアッセイおよびpremixアッセイ)にあ らかじめ固相化した場合、Octet Data Analysis ソフトウェアはマト 考慮事項:Ab1は、すべてのモノクローナル抗体の結合シグナルが0.5 リックスを作成できません。この方法でアッセイを実行する場合 ~1 nmとなる最適な濃度(50~200 nM)でバイオセンサーに固相化 は、ベースラインステップ、または抗原アソシエーションステップ する必要があります。信頼性の高いデータを得るには、抗原親和性の (Classical sandwichのみ)の各ウェルのサンプルIDに、対応する固 高い抗体をバイオセンサーに結合する必要があります。弱い親和性モ 相化モノクローナル抗体をラベル付けしてください。 ノクローナル抗体の固相化では、Ab2とのインキュベーション前に抗 原が解離することがあります。抗原のすべての結合部位がバイオセン 事前設定されたテンプレートは、推奨される撹拌速度とステップ時 サー結合抗体で完全に飽和されない可能性があるため、このビニング 間を提供します。ただし、これらのパラメータは、相互作用の速度 形式は、多価抗原または抗原の不均一な混合物には不適切です。固相 と強度に応じて変更される場合があります。ローディングの撹拌速 化モノクローナル抗体とサンドイッチモノクローナル抗体の間、また 度と2つのアソシエーションステップは、必要に応じて400 RPMから はサンドイッチモノクローナル抗体とバイオセンサー表面の間に交差 1500 RPMの間で変更できます。 反応がないことを確認することが不可欠です。サンドイッチモノク ローナル抗体(Ab2)濃度は通常、結合モノクローナル抗体(Ab1) 濃度と同じです。 IN-TANDEM 考慮事項:一般に、抗原は低レベルで固相化されており、密集する コントロール:抗体間の交差反応がなく、Ab2シグナルが抗原依存性 ことによるアーティファクトを最小限に抑え、可能な限り、キャプ のみであることを確認するために、抗原なしのコントロールを測定し チャベースのバイオセンサーを使用してタグを介して固相化されて てください。このフォーマットでのもう1つの重要なコントロール います。飽和モノクローナル抗体(Ab1)と競合モノクローナル抗 は、無関係の抗体、できれば他のカップリングモノクローナル抗体と 体(Ab2)は、100~400 nMの範囲の同じ濃度でテストされます。 同じアイソタイプおよび動物種の抗体を固相化し、抗原結合とAb2結 競合する抗体(Ab2)の濃度は、飽和抗体(Ab1)の濃度の2分の1 合を測定します。これは固相化抗体やセンサーへの非特異的結合を促 または3分の1でテストして、セルフバインディングが無視できるこ 進する可能性のある露出した「粘着性」のエピトープを持つAb2を特 とが示された場合、試薬を節約することができます。 定することを目的としています。 コントロール:エピトープビニングをin-tandem形式で実行する場 合は、抗原がロードされたバイオセンサーをAb1の代わりに培地ま PREMIX たはバッファーに浸し、次にすべての競合抗体(Ab2)に浸し 考慮事項:すべてのAb1分子は、最適な濃度(50‒200 nM)で 0.5‒1 て、Ab1が存在しない場合の各Ab2の抗原への「最大」結合量を決定 nmの結合シグナルとなるようにバイオセンサーに固相化する必要があ するコントロールが不可欠です。 ります。あらかじめ混合したモノクローナル抗体(Ab2)の濃度 は、KD値の約10倍で、抗原を超えている必要があります。抗原とAb2 を室温で4~5時間、または4℃で一晩プレミックスして、抗原をAb2で 完全に飽和させます。モノクローナル抗体間の交差反応性がごくわず かであることも確認する必要があります。 図12:Octet Data Acquisition Software v8.0以降で利用可能なエピトープビニングテンプレート。 Octet HTXでは32x32マトリックステンプレートを使用できます。 14
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コントロール:Premixアッセイには常に抗原のみのコントロールが必 2 ステップの最後から適切な時間間隔を設定して、マトリックスのレ 要です。つまり、抗原はAb2なしでインキュベートされます。抗原+ ポートポイントとして表示される平均nmシフトを決定する必要があり ます。デフォルトの時間枠は、その特定のステップの合計時間の最後 Ab2複合体が固相化モノクローナル抗体に結合できる場合、それは抗 の10%です。 原のみのコントロールよりもシグナルが高くなりますが、抗原+ Ab2複 合体が固相化モノクローナル抗体に結合できない場合、バイオセン 3 フラグをマトリックスに組み込んで、レスポンダーの低さやバイン サーに結合したAb1に結合できる抗原がないためシグナルが減少しま ダーの弱さを強調することができます。低応答(%)は、ステップ内 す。中間の結合反応が観察された場合、プレミックスしたモノクロー の他のトレース(または他のバイオセンサー)に比べてアソシエー ナル抗体(Ab2)の濃度系列に対して測定することで、ブロッキング ションシグナルが大幅に低いトレースにフラグを付けるために使用さ が濃度依存性であることを確認できます。すべてのプレミックスを無 れます。 弱い結合(%)フラグは、解離が高いトレースを強調表示す 関係な抗体結合バイオセンサーにさらして、非特異的結合を促進する るために使用されます。 これは、ベースライン/解離ステップの最初の 可能性のある露出した「粘着性」のエピトープを持つプレミックスを データポイントに対するnmシフトの減少率を計算することによって測 特定する必要があります。 定されます。 最適な結果を得るために、アッセイを実行するための推奨温度は30°C 4 ビニング実験では、特定のステップをグラフで選択し、「Use this です。分析中、一定の温度を維持するには、周囲温度より数度高い温 step to normalize the second antibody」ボックスをチェックすること 度で測定する必要があります。 により、Ab2データをそのステップで正規化できます。 一連のバイオ センサーに同じAb1と抗原がロードされ、次にAb2のアレイがアソシ エーションする場合、Ab2応答を正規化することで、バイオセンサー間 データ分析(バージョン8.0 以降) のAb1または抗原のロードの変動による影響を最小限に抑えることがで きます。 エピトープビニング実験が完了したら、Octet Data Analysisソフト ウェア(バージョン8.0 以降)による解析を開始します。エピトープ ビニングデータを読み込んで処理し、マトリックスを作成する方法の 「Create the Matrix」ボタンを選択すると、Ab2が行に、Ab1が列にプ 詳細については、データ分析ソフトウェアの「Help」セクションにあ ロットされた2次元マトリックスが生成されます。データは、「Step る「Octet Data Analysis Software User Guide」のエピトープビニング Calculation Parameters window」での選択に基づいて、nmシフトの セクションを参照してください。 生データ、またはAb2バインディングの正規化されたデータ(比率)と して表示されます。マトリックスが生成されたら、「Color ソフトウェアの「Processing」タブで「Process Epitope Binning Threshold」ボタンを使用して閾値を設定し、赤と緑でそれぞれ色分け Data」を選択すると、ベースライン、ローディング、およびアソシ することにより、Ab1によってブロックされているかどうかを判別でき エーションステップの繰り返しシーケンスが検索され、新しい ます。 Binningタブにトレースがオーバーレイされます。「センサーチェッ ク」など、アッセイの最初に追加のステップがある場合、これは繰り マトリックスデータは、Microsoft®Excel®などの外部分析プログラム 返されないため、ソフトウェアがトレースをオーバーレイすることを にコピーして貼り付けることができます。あるいは、「Export to CSV 妨げます。そこで、次にBinningタブの「Binning Parameters」の下 File」ボタンをクリックして、オーバーレイされたトレースのグラフ にある「Steps to Skip」ボタンを使用することで、繰り返しシーケン とともにマトリックスデータをエクスポートできます。閾値に基づく スを探す際の追加のステップを無視できます(図13 A)。ソフトウェ 色分けはマトリックスと共にエクスポートされないことに注意する必 アはビニング結果をオーバーレイできるようになります。 要があります。以下に概説するように、条件付きフォーマットを使用 して手動で設定する必要があります。 トレースがオーバーレイされた後、2次元マトリックスを生成するため に次の4つ条件を設定する必要があります。これらはすべて、ステップ Octet Data Analysis ソフトウェアを使用して、ビニングデータに対し 計算パラメーターウィンドウで実行できます(図13 B)。 て追加レベルの分析を行うことができます。ユーザーがAb1の存在下 と不在下でAb2結合曲線の初期勾配を比較することに関心がある場 1 関連するステップをステップ計算テーブル(図13 A)に追加する必 合、 Ab2アソシエーションステップを選択して、「Processing」タブ 要があります。これは、グラフでステップを選択して「Add Step の「Quantitate Selected Step」を使用して定量化できます。このス Calculation Parameters」ボタンをクリックすることで実行できます。 テップは、ソフトウェアの定量モジュールで開き、初期勾配は これにより「Step Calculation Parameters」ウィンドウ(図13 B)が 「Binding Rate Equation」で計算できます。結合曲線の最初の勾配 開きます。このウィンドウでは、さまざまなステップを「First は、Ab2の抗原への結合プロファイルがAb1の存在下で変化する場合 Antibody」、「Second Antibody」、または「None」(ベースライン にしばしば比較されます。これは、Ab1が結合時に抗原の立体構造変 または抗原)として割り当てる必要があります。 化を引き起こすアロステリック効果を起こす場合です。 注:AR2Gバイオセンサーへのモノクローナル抗体のローディングが別 の実験で行われた場合、測定メソッド作成中に対応する固相化モノク バージョン12では、上級ユーザー向けに新しい定量的フィッティング ローナル抗体サンプルIDでラベル付けされたステップを「First モデル分類が追加されています。モデル分類(図14)は、結合相互作 Antibody」として割り当てる必要があります。 用に最適なものを選択し、結合トレース生データの上にフィットト レースをオーバーレイするのに役立ちます。 15
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A 図13:Octet Data Analysis Software v12.x以降を使用したエピトープビニング解析。(A)「Step Settings」タブ、「Threshold Settings」、および「Color Scheme」オプションが強調表示されます。(B)「Step Settings」タブの「Edit」ボタンをクリックすると、「Edit Step Settings」ウィンドウが開きます。この ウィンドウでは、2次元のビニングマトリックスを作成するために、さまざまなパラメータを定義できます。これらには、ステップ時間を指定することによるnmシ フトレポートポイントの計算、低レスポンダーまたは弱いバインダーに基づく問題のあるデータのフラグ付け、および抗体2結合ステップのnmシフトの正規化が含 まれます。 B The Legacy model は、結合トレース生データの最大勾配に基づいて フィッティングモデル(単一指数、二重指数)を選択します。 The Best Fit model は、結合トレース生データとフィッティング データの差である残差を最小限に抑えるようにします。異なるモデル 間(単一指数、二重指数)で差が無い場合、Best Fit モデルは2つのモ デルのより単純な方を選択します。 The Single Exponential model は、結合トレース生データを単一の 指数数学モデルに強制的に適合させます。 このモデルは既知の1:1 結合相互作用に最適であるかもしれません。 分析後データのエクスポート データのエクスポートに続いて、閾値を定義して、Ab1によってブ ロックされている、またはブロックされていないAb2を区別する必要 があります。 すべてのビニングアッセイ形式では、閾値は通常パネ ル内で最も高いセルフバインディングシグナルとして設定されま す。セルフバインディングの閾値が適切であることを確認するに は、いくつかの事項を考慮する必要があります。 • Classical sandwich and Premix:閾値を設定する前に、抗原なし のコントロールと無関係なIgG結合バイオセンサーコントロールのす • In-tandem:Ab2結合シグナルは、Ab2のみのコントロールシグ べてのAb2からのシグナルが最小限であることを確認してくださ ナル(Ab1なし)で除算することにより正規化して、Ab2がAb1 い。これらの信号が最も高いセルフバインディングシグナルよりも によってブロックされているかどうかを明確に区別できます。正 低い場合、セルフバインディングの閾値は適切であると見なすこと 規化に続いて、適切なセルフバインディングの閾値を使用できま ができます。そうでない場合は、閾値を調整することを検討すべき かもしれません。 す。 一度閾値を設定すると、Excelのマトリックスで条件付き書式を実行で きます。図15に示すように、Ab1によってブロックされている、また はブロックされていないAb2を視覚的に識別するために、条件付き フォーマットで色を使用します。 16
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PEARSON関数を使用して、マトリックス内の未加工のnmシフトまた 手動のHeightカットオフ値は、クラスターグラムのビンを定義するた は正規化データをさらに分析できます (Reference 5) 。ピアソン相関 めに使用されます。Heightカットオフ値を設定するときは注意が必要 係数は、最初のモノクローナル抗体行に対するすべてのモノクローナ です。Heightカットオフ値が高すぎると、ビンに非常に異なるモノク ル抗体行に対して計算され、最初の行に続いて最も高い相関係数を持 ローナル抗体が含まれ、Heightカットオフ値が低すぎると、同様のモ つ行が配置されます。このプロセスは、すべての行の配置がソートさ ノクローナル抗体が異なるビンに分離されます。さらにmulti-scale れるまで繰り返され、モノクローナル抗体列にも適用されます。一番 bootstrap resamplingを使用して計算されたAU (Approximate 上の行と一番左の列にある2つの抗体は、ピアソンソーティングでの Unbiased)p値を使用して、ビンの割り当てを確認できます。95を 抗体の順序に影響することに注意することが重要です。大規模なビニ 超えるAU p値カットオフは、このビンが存在しないという仮説が0.05 ング実験が行われる場合、ピアソン相関係数は、行内の競合するモノ の有意水準で拒否されることを意味します。図18のHeightカットオ クローナル抗体(Ab2)に対してのみ計算できます。ピアソンソー フが0.2の場合、6つの異なるビンが出現しました。階層的クラスター ティング後、列内のAb1は、すべての自己結合ペアがマトリックスの 割り当ては、図16の右端の列にもリストされています。この方法論の 対角線上にあるように再配置できます(図16中で、赤で強調表示)。 詳細については、Liao-Chan et al. (Reference 4) を参照してくださ この方法論の詳細については、Liao-Chan et al. (Reference 4) を参照 い。 してください。 エピトープビニングにより、各ビンから代表的な少数のモノクローナ さらに、ビニングデータは、pvclustパッケージを使用してクラスター ル抗体の同定が容易になり、低スループットの機能アッセイフォー グラムを生成するために、統計計算プログラム R(Statistical マットでより詳細な特性評価が可能になります。図16および18のビ ComputingのRプロジェクト:www.r-project.org)にインポートする ニングデータに従って、6つのビンのそれぞれからの2つまたは3つの ことによって分析できます (Reference 6) 。同様の分析は、他のソフ 抗体と割り当てられていないモノクローナル抗体がさらなる解析に進 トウェアパッケージ(Partekなど)でも可能です。ピアソン分類の前 みました。少数の多様なモノクローナル抗体のセットをさらに調べる に、図15の正規化データをpvclustで分析して、図18に示すクラス ことにより、抗原の機能的エピトープを標的とし、望ましい生物学的 ターグラムを生成しました。クラスターグラムのy軸は「Height」と 結果をもたらすリード抗体分子の同定が容易になる可能性がありま 呼ばれ、抗体間の非類似性の尺度です。 す。 Octet Data Analysis HTソフトウェアバージョン12には、BinChartと 呼ばれる新しい機能があり、分析中に設定された結合閾値に基づい て、スクリーニングされた抗体をビニングします。この閾値は、図17 の閾値の変化の結果として、抗体のビニングの変化を分析するために 調整できます。 新しいビニングソフトウェアでは、2組の観測AとBの間で一般的に使 用される同様のメトリクスが利用できます。「Maximum」または 「Pearson」から始めることをお勧めしますが、「Euclidean」から始 めることもできます。一般的に、クラスタリングのマージとスプリッ トは貪欲法で決定されます。階層的クラスタリングの結果は通常、樹 状図で表示されます。すべてのクラスタリング式の詳細は、HTソフト ウェアにある「Data Analysis HT User Guide」の「Hierarchical Clustering Formulas」にまとめられています。 適切なメトリクスの 選択は、クラスターの形状に影響します。単結合の特別な場合を除い て、アルゴリズム(網羅的探索を除く)はどれも、最適なソリュー ションを見つけることを保証できません。 どのクラスターを組み合わせるか、またはクラスターを分割する必要 がある場合を決定するには、観測値のセット間の非類似度の測定が必 要です。階層的クラスタリングのほとんどの方法では、これは適切な メトリクス(観測値のペア間の距離の測定)と、セット内の観測値の ペアごとの距離の関数としてセットの非類似性を指定するリンケージ 基準を使用することで実現されます。リンケージ基準は、観測値のペ ア間の距離の関数として、観測値のセット間の距離を決定します。 2 つの観測セットAとBの間で一般的に使用されるいくつかのリンケージ 基準も利用可能であり、「Data Analysis HT User Guide」の 「Hierarchical Clustering Formulas」にまとめられています。 最適化された「Report」タブを使用して、任意の数のデータポイント を含むエクスポート可能なレポートを作成できます。新機能として、 データテーブルを変更およびソートする機能と、柔軟なフォント設定 図14:モデル分類を選択するための詳細設定 オプションのスクリーンショット。 が追加されました。 17
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図15:43種類の抗DPEP1 モノクローナル抗体のin-tandem ビニングアッセイの2次元マトリックス。Octet Data Analysis ソフトウェア v8.0で、Ab2を行に、Ab1を列 にプロットすることにより、マトリックスが作成されました。次にこのデータセットをMicrosoft Excelにエクスポートし、閾値(27)に基づいて正規化し、色分けし て、 Ab1によってブロックされた(赤)またはブロックされなかった(緑)Ab2を区別するための条件付きフォーマットを使用しました。データの正規化は、Ab2のシ グナルをAb2のみ(Ab1なし)のシグナルで除算し、100倍することで行われました。Liao-Chanらのデータセットです (Reference 4) 。 Supplementary Fig. 4 A # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 1 R48C2-34-69 7 12 10 7 12 9 11 9 6 11 7 10 6 6 18 9 4 6 3 7 2 6 5 11 45 33 7 7 12 29 41 14 34 54 66 33 70 72 43 49 41 30 95 A 2 R48C1-67-20 4 8 5 3 10 4 8 6 3 6 2 7 1 1 12 2 3 2 0 7 1 5 -2 4 54 36 3 1 5 21 39 18 43 85 83 45 71 73 49 47 32 23 95 0.97 A 3 R48C2-34-45 12 18 12 11 16 11 17 11 8 13 6 13 9 6 23 11 7 9 6 12 8 9 4 11 55 39 7 6 12 24 42 18 46 85 80 48 68 74 47 48 32 28 91 1.00 A 4 R48C1-67-53 9 12 8 6 12 9 11 10 6 13 5 11 7 4 20 8 3 6 7 9 5 6 3 9 50 30 5 5 11 26 33 16 37 82 70 30 61 69 41 37 29 23 83 0.99 A 5 R48C1-67-40 7 6 5 4 8 4 10 5 0 10 -2 5 2 -1 20 2 5 10 3 2 1 3 -1 3 52 31 2 1 2 41 35 13 35 98 90 34 55 79 44 43 26 19 90 0.99 A 6 R48C2-34-01 11 15 9 9 12 8 21 14 6 20 6 11 6 3 30 9 10 15 7 8 6 8 2 8 57 37 6 4 9 38 36 17 35 94 85 37 66 67 47 48 29 24 87 0.99 A 7 R48C1-67-46 9 9 5 7 11 6 11 5 3 11 1 8 3 1 21 6 1 6 9 11 6 5 -1 6 49 30 2 1 10 22 29 9 31 102 95 40 67 71 44 34 26 19 88 0.98 A 8 R48C1-67-08 10 16 10 10 12 6 18 10 4 12 9 15 4 8 22 9 5 6 13 14 8 9 2 9 47 35 11 10 16 28 46 27 47 88 87 45 62 72 38 31 36 28 79 0.98 A 9 R48C1-67-02 13 19 12 12 16 12 19 13 8 17 8 15 9 8 27 12 5 8 11 15 10 11 4 15 61 40 10 9 14 34 61 41 67 96 94 37 69 88 42 44 39 33 104 0.98 A 10 R48C1-67-88 9 15 11 7 17 9 11 7 5 10 9 14 7 7 20 8 4 5 5 12 6 10 4 10 60 41 10 6 13 22 58 40 62 78 78 45 65 75 41 43 40 31 90 0.99 A 11 R48C2-5-03 14 22 19 14 25 16 16 12 11 18 13 21 14 13 28 16 10 10 9 19 11 16 6 16 63 45 16 11 20 27 61 41 59 74 75 44 66 74 43 47 45 39 106 0.99 A 12 R48C1-67-44 8 13 7 6 12 6 10 8 4 9 3 9 5 1 17 5 3 4 1 6 3 6 0 6 54 37 4 3 7 22 60 45 71 83 74 37 69 70 41 44 30 23 102 0.98 A 13 R48C2-34-08 13 21 14 14 18 10 12 7 8 14 8 16 11 7 20 11 8 9 6 13 6 12 4 12 52 34 8 7 14 21 65 48 70 87 75 41 71 65 41 47 31 27 107 1.00 A 14 R48C2-5-02 16 23 17 15 22 17 15 13 13 19 12 19 13 9 27 15 11 13 11 15 10 16 8 17 61 44 13 9 19 25 55 33 57 79 80 46 71 79 40 52 43 39 81 0.97 A 15 R48C1-67-34 2 8 5 3 10 3 7 5 0 3 2 6 0 1 11 0 -1 1 2 6 3 4 -3 2 58 36 2 -1 6 14 50 29 53 73 73 36 63 65 34 42 28 23 58 0.99 A 16 R48C1-67-03 11 13 10 8 12 10 12 7 6 8 7 11 7 6 18 6 10 16 4 10 10 10 3 9 49 31 6 4 9 48 52 34 53 88 94 35 67 85 40 44 37 30 86 0.96 A 17 R48C1-67-41 12 19 14 11 18 13 16 17 10 16 10 16 11 9 23 13 7 8 6 13 5 12 7 14 61 40 10 11 17 30 29 12 24 88 100 40 66 98 49 45 42 36 101 0.94 A 18 R48C1-67-09 9 14 11 8 13 9 13 14 6 12 8 12 8 8 20 10 5 6 5 10 5 10 5 11 49 36 8 8 14 29 21 10 15 91 88 42 65 85 46 44 39 30 79 0.99 A 19 R48C1-67-37 11 20 21 10 25 19 13 13 18 18 18 20 19 17 29 22 11 12 12 19 12 19 12 22 59 37 19 18 22 32 33 17 21 69 71 38 60 61 53 49 35 33 66 0.97 A 20 R48C1-67-43 11 19 13 12 19 11 14 9 7 15 5 14 7 6 26 10 7 8 4 10 6 10 2 12 61 53 7 -1 8 25 34 6 15 68 71 36 76 74 41 54 45 33 108 0.94 A 21 R48C1-67-21 16 27 19 17 24 17 22 18 14 20 15 22 16 13 29 16 12 13 8 18 12 17 10 19 75 58 16 6 13 33 34 19 20 59 61 37 72 83 42 51 48 38 103 0.99 A 22 R48C1-67-04 11 12 7 9 12 8 14 7 4 14 4 10 6 3 19 7 5 7 3 5 4 8 1 8 45 31 4 4 12 16 30 13 33 90 56 27 55 53 32 36 28 19 77 0.90 A 23 R48C2-5-12 10 21 24 12 30 22 18 10 20 22 21 28 20 20 30 21 9 10 12 27 14 25 12 25 50 39 20 15 26 31 55 29 49 76 72 37 59 63 51 43 39 35 85 0.94 A 24 R48C2-34-09 13 20 14 11 18 9 19 -1 5 14 5 15 6 3 27 6 7 7 0 9 0 10 -2 10 32 17 5 4 14 17 61 32 49 66 65 37 73 82 32 23 41 33 103 0.93 A 25 R48C2-34-126 15 20 16 8 14 7 8 3 5 17 6 13 4 7 26 7 6 9 2 5 0 7 5 7 10 15 11 9 18 10 30 5 15 16 29 11 44 37 19 23 23 24 52 0.87 E 26 R48C2-34-30 21 22 20 8 15 7 2 -8 1 22 3 11 1 4 31 -2 5 8 -4 4 -8 3 2 2 12 13 7 4 21 -4 27 -9 18 -8 8 -5 33 40 9 9 18 15 50 0.85 E 27 R48C2-5-04 14 31 27 16 31 23 19 12 16 24 19 29 21 19 35 21 12 14 12 24 13 24 9 28 35 37 20 14 26 25 69 37 62 21 26 -2 37 30 20 16 20 25 28 0.49 unassigned 28 R48C2-34-43 19 23 15 17 21 16 22 15 14 16 13 18 12 10 25 13 13 14 0 14 8 15 7 16 52 40 13 9 17 33 63 40 66 50 54 28 21 18 39 64 45 38 111 0.48 F 29 R48C2-34-04 17 17 12 11 21 15 14 11 12 18 6 16 11 5 27 8 12 17 2 9 6 14 4 13 55 37 7 7 11 27 66 38 61 53 59 24 13 16 37 58 50 34 120 0.99 F 30 R48C2-5-109 4 10 9 4 15 1 5 -4 0 -1 8 8 -3 8 10 -1 5 7 6 10 3 10 2 0 44 25 8 21 33 13 18 0 4 61 71 24 57 71 32 34 6 13 3 0.27 unassigned 31 R48C2-5-13 21 29 62 44 79 62 1 -25 47 21 25 63 42 25 40 23 11 -6 -4 -3 -4 75 46 29 15 7 25 9 17 29 27 -6 2 28 35 13 156 139 19 -1 6 10 11 0.43 D 32 R48C2-5-14 25 44 70 54 86 70 19 -5 49 61 52 68 57 47 77 40 18 14 9 18 11 84 54 45 27 24 44 24 40 32 43 14 22 39 46 31 117 100 34 20 17 21 21 0.94 D 33 R48C2-5-01 96 46 84 79 114 101 39 21 89 155 44 80 72 51 170 42 29 28 7 7 5 84 67 60 78 39 34 44 61 34 16 7 8 73 96 35 72 96 40 46 9 12 15 0.70 unassigned 34 R48C1-67-18 14 65 110 85 117 126 -26 -40 110 201 57 93 88 63 219 52 72 94 57 32 106 97 84 79 65 -20 40 0 4 39 41 15 33 23 30 6 12 -3 24 4 9 15 11 0.63 unassigned 35 R48C1-67-89 30 44 96 47 75 91 39 23 53 96 42 69 65 54 104 33 79 85 55 25 32 77 59 59 41 18 33 -4 3 14 31 9 24 17 18 0 6 0 18 5 1 7 7 0.86 B 36 R48C1-67-33 48 50 89 64 84 91 41 32 61 88 57 82 72 63 94 46 67 84 68 48 64 81 70 72 66 38 47 2 9 26 42 15 36 30 34 13 11 5 33 12 10 15 15 0.96 B 37 R48C1-67-49 87 49 93 67 123 105 46 26 69 87 53 84 76 64 108 55 88 111 100 56 82 102 74 74 76 53 43 7 14 40 48 16 45 56 60 27 10 17 43 28 13 12 27 0.94 B 38 R48C1-67-90 72 43 80 76 100 89 38 23 76 78 44 73 68 53 86 44 77 87 80 42 57 79 64 56 69 39 37 8 16 47 59 35 53 43 44 21 11 8 39 27 16 17 25 0.96 B 39 R48C1-67-19 27 49 74 48 79 55 52 35 46 57 36 48 37 40 71 15 84 88 53 33 40 57 45 30 30 26 27 1 15 3 37 3 11 21 25 3 18 0 25 3 11 20 9 0.81 unassigned 40 R48C2-34-80 66 35 65 52 76 67 27 12 41 51 43 56 45 45 63 36 62 72 66 43 56 65 52 40 59 31 37 51 62 31 36 12 29 26 33 13 11 4 27 7 28 23 68 0.66 unassigned 41 R48C2-34-42 82 31 59 59 79 74 33 17 53 45 37 60 53 42 62 42 48 45 53 41 49 65 48 52 68 36 34 54 66 29 22 7 12 43 46 19 22 27 37 47 8 12 8 0.70 C 42 R48C2-34-75 73 20 48 51 71 62 26 14 38 35 30 47 44 33 52 31 34 33 42 30 39 53 38 40 64 32 27 47 62 21 13 2 5 39 43 16 17 18 32 43 4 6 4 0.99 C 43 R48C2-34-06 119 82 20 113 38 16 99 90 13 62 34 16 24 28 83 13 67 50 7 75 88 16 29 21 122 115 36 10 22 56 24 8 13 25 30 46 52 13 28 122 13 20 12 0.25 unassigned B au 図16:タンデムビニングアッセイでプロファイルされた43種類の抗DPEP1 モノクローナル抗体のパネルの2次元マトリックス。飽和抗体(Ab1s)と競合抗体 (Ab2s)は、それぞれ列と行にリストされています。Ab2バインディングシグナルをAb2のみのシグナル(Ab1なし)で割り、100を掛けました。Ab2のピアソン相 関係数は、最後から2番目の列にリストされています。8ピ6 アソン相関係数はAb2に対してのみ計算され、対角線上のすべての自己結合ペアは正規化された結合応答が 赤で強調表示されていることに注意してください。青色のグラデーションは、0(青)から75(白)の正規化されたデータに適用され、ブロッキングを強調表示し ます。図はLiao-Chan et al. (Reference 4) を基にしました8。1 98 60 99 62 78 78 78 94 98 89 0.2 99 81 96 83 8876 1 100 99 100 98 74 8587 810 9 87 91 009668 100 9150096 85 95 98 97 100 18 Cluster: E F A D B C Height 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 R48C2−5−04 R48C2−34−126 mAb2 \ mAb1 R48C2−34−30 R48C2−5−109 R48C2−34−04 R48C2−34−43 R48C2-34-69 R48C2−34−09 R48C2−34−69 R48C1−67−21 R48C1-67-20 R48C1−67−43 R48C2−5−12 R48C2-34-45 R48C1−67−03 R48C1−67−08 R48C1-67-53 R48C1−67−02 R48C1−67−34 R48C2−5−02 R48C1-67-40 R48C1−67−44 R48C2−34−08 R48C2-34-01 R48C1−67−88 R48C2−5−03 R48C1−67−37 R48C1-67-46 R48C1−67−09 R48C1−67−41 R48C1-67-08 R48C1−67−04 R48C1−67−53 R48C1-67-02 R48C1−67−20 R48C2−34−45 R48C1−67−46 R48C1-67-88 R48C1−67−40 R48C2−34−01 R48C2-5-03 R48C2−34−06 R48C2−5−13 R48C1-67-44 R48C2−5−14 R48C2−34−80 R48C1−67−18 R48C2-34-08 R48C1−67−19 R48C1−67−89 R48C2-5-02 R48C1−67−33 R48C1−67−90 R48C1-67-34 R48C1−67−49 R48C2−5−01 R48C2−34−42 R48C1-67-03 R48C2−34−75 R48C1-67-41 R48C1-67-09 R48C1-67-37 R48C1-67-43 R48C1-67-21 R48C1-67-04 R48C2-5-12 R48C2-34-09 R48C2-34-126 R48C2-34-30 R48C2-5-04 R48C2-34-43 R48C2-34-04 R48C2-5-109 R48C2-5-13 R48C2-5-14 R48C2-5-01 R48C1-67-18 R48C1-67-89 R48C1-67-33 R48C1-67-49 R48C1-67-90 R48C1-67-19 R48C2-34-80 R48C2-34-42 R48C2-34-75 R48C2-34-06 Pearson Full-pairwise biosensor cluster
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A B 図17:Octet Data Analysis HT ソフトウェアのエピトープビニング機能は、センサーグラムやその他の分析機能に加えて、ヒートマップとBinChartを提供します。 (A)「Gradient Red/Green」配色を使用した32x64画面のヒートマップの例。5つの異なる配色を選択できます。色勾配スキームを使用して、設定した閾値と比 較した結合の強度を分析できます。閾値設定と同等のバインディング値は、ニュートラル/白の色で表示されます。結合信号と閾値設定の差が大きいほど、その結 合相互作用に対して表示される色は暗くなります。閾値から最も離れた結合相互作用は、色の最も暗い色合いで表示されます。 (B)32x64画面のBinChartの例。 各ビンは、抗原を結合する互いの能力をブロックする抗体を表し、パネル内の他の抗体とペアにされたときに同様のブロックプロファイルを持ちます。この例は、 低結合nmでの閾値設定(「Matrix color threshold settings」)を使用して作成されたため、各ビン内の抗体数が少なくなりました。マウスの矢印をビンに合わせ ると、BinChartウィンドウの上部にそのビン内の抗体のリストも表示されます。より高い結合nmでの閾値設定を使用すると、多くの抗体がより少ないビンにグ ループ化されます。 19
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Supplementary Fig. 4 A # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 1 R48C2-34-69 7 12 10 7 12 9 11 9 6 11 7 10 6 6 18 9 4 6 3 7 2 6 5 11 45 33 7 7 12 29 41 14 34 54 66 33 70 72 43 49 41 30 95 A 2 R48C1-67-20 4 8 5 3 10 4 8 6 3 6 2 7 1 1 12 2 3 2 0 7 1 5 -2 4 54 36 3 1 5 21 39 18 43 85 83 45 71 73 49 47 32 23 95 0.97 A 3 R48C2-34-45 12 18 12 11 16 11 17 11 8 13 6 13 9 6 23 11 7 9 6 12 8 9 4 11 55 39 7 6 12 24 42 18 46 85 80 48 68 74 47 48 32 28 91 1.00 A 4 R48C1-67-53 9 12 8 6 12 9 11 10 6 13 5 11 7 4 20 8 3 6 7 9 5 6 3 9 50 30 5 5 11 26 33 16 37 82 70 30 61 69 41 37 29 23 83 0.99 A 5 R48C1-67-40 7 6 5 4 8 4 10 5 0 10 -2 5 2 -1 20 2 5 10 3 2 1 3 -1 3 52 31 2 1 2 41 35 13 35 98 90 34 55 79 44 43 26 19 90 0.99 A 6 R48C2-34-01 11 15 9 9 12 8 21 14 6 20 6 11 6 3 30 9 10 15 7 8 6 8 2 8 57 37 6 4 9 38 36 17 35 94 85 37 66 67 47 48 29 24 87 0.99 A 7 R48C1-67-46 9 9 5 7 11 6 11 5 3 11 1 8 3 1 21 6 1 6 9 11 6 5 -1 6 49 30 2 1 10 22 29 9 31 102 95 40 67 71 44 34 26 19 88 0.98 A 8 R48C1-67-08 10 16 10 10 12 6 18 10 4 12 9 15 4 8 22 9 5 6 13 14 8 9 2 9 47 35 11 10 16 28 46 27 47 88 87 45 62 72 38 31 36 28 79 0.98 A 9 R48C1-67-02 13 19 12 12 16 12 19 13 8 17 8 15 9 8 27 12 5 8 11 15 10 11 4 15 61 40 10 9 14 34 61 41 67 96 94 37 69 88 42 44 39 33 104 0.98 A 10 R48C1-67-88 9 15 11 7 17 9 11 7 5 10 9 14 7 7 20 8 4 5 5 12 6 10 4 10 60 41 10 6 13 22 58 40 62 78 78 45 65 75 41 43 40 31 90 0.99 A 11 R48C2-5-03 14 22 19 14 25 16 16 12 11 18 13 21 14 13 28 16 10 10 9 19 11 16 6 16 63 45 16 11 20 27 61 41 59 74 75 44 66 74 43 47 45 39 106 0.99 A 12 R48C1-67-44 8 13 7 6 12 6 10 8 4 9 3 9 5 1 17 5 3 4 1 6 3 6 0 6 54 37 4 3 7 22 60 45 71 83 74 37 69 70 41 44 30 23 102 0.98 A 13 R48C2-34-08 13 21 14 14 18 10 12 7 8 14 8 16 11 7 20 11 8 9 6 13 6 12 4 12 52 34 8 7 14 21 65 48 70 87 75 41 71 65 41 47 31 27 107 1.00 A 14 R48C2-5-02 16 23 17 15 22 17 15 13 13 19 12 19 13 9 27 15 11 13 11 15 10 16 8 17 61 44 13 9 19 25 55 33 57 79 80 46 71 79 40 52 43 39 81 0.97 A 15 R48C1-67-34 2 8 5 3 10 3 7 5 0 3 2 6 0 1 11 0 -1 1 2 6 3 4 -3 2 58 36 2 -1 6 14 50 29 53 73 73 36 63 65 34 42 28 23 58 0.99 A 16 R48C1-67-03 11 13 10 8 12 10 12 7 6 8 7 11 7 6 18 6 10 16 4 10 10 10 3 9 49 31 6 4 9 48 52 34 53 88 94 35 67 85 40 44 37 30 86 0.96 A 17 R48C1-67-41 12 19 14 11 18 13 16 17 10 16 10 16 11 9 23 13 7 8 6 13 5 12 7 14 61 40 10 11 17 30 29 12 24 88 100 40 66 98 49 45 42 36 101 0.94 A 18 R48C1-67-09 9 14 11 8 13 9 13 14 6 12 8 12 8 8 20 10 5 6 5 10 5 10 5 11 49 36 8 8 14 29 21 10 15 91 88 42 65 85 46 44 39 30 79 0.99 A 19 R48C1-67-37 11 20 21 10 25 19 13 13 18 18 18 20 19 17 29 22 11 12 12 19 12 19 12 22 59 37 19 18 22 32 33 17 21 69 71 38 60 61 53 49 35 33 66 0.97 A 20 R48C1-67-43 11 19 13 12 19 11 14 9 7 15 5 14 7 6 26 10 7 8 4 10 6 10 2 12 61 53 7 -1 8 25 34 6 15 68 71 36 76 74 41 54 45 33 108 0.94 A 21 R48C1-67-21 16 27 19 17 24 17 22 18 14 20 15 22 16 13 29 16 12 13 8 18 12 17 10 19 75 58 16 6 13 33 34 19 20 59 61 37 72 83 42 51 48 38 103 0.99 A 22 R48C1-67-04 11 12 7 9 12 8 14 7 4 14 4 10 6 3 19 7 5 7 3 5 4 8 1 8 45 31 4 4 12 16 30 13 33 90 56 27 55 53 32 36 28 19 77 0.90 A 23 R48C2-5-12 10 21 24 12 30 22 18 10 20 22 21 28 20 20 30 21 9 10 12 27 14 25 12 25 50 39 20 15 26 31 55 29 49 76 72 37 59 63 51 43 39 35 85 0.94 A 24 R48C2-34-09 13 20 14 11 18 9 19 -1 5 14 5 15 6 3 27 6 7 7 0 9 0 10 -2 10 32 17 5 4 14 17 61 32 49 66 65 37 73 82 32 23 41 33 103 0.93 A 25 R48C2-34-126 15 20 16 8 14 7 8 3 5 17 6 13 4 7 26 7 6 9 2 5 0 7 5 7 10 15 11 9 18 10 30 5 15 16 29 11 44 37 19 23 23 24 52 0.87 E 26 R48C2-34-30 21 22 20 8 15 7 2 -8 1 22 3 11 1 4 31 -2 5 8 -4 4 -8 3 2 2 12 13 7 4 21 -4 27 -9 18 -8 8 -5 33 40 9 9 18 15 50 0.85 E 27 R48C2-5-04 14 31 27 16 31 23 19 12 16 24 19 29 21 19 35 21 12 14 12 24 13 24 9 28 35 37 20 14 26 25 69 37 62 21 26 -2 37 30 20 16 20 25 28 0.49 unassigned 28 R48C2-34-43 19 23 15 17 21 16 22 15 14 16 13 18 12 10 25 13 13 14 0 14 8 15 7 16 52 40 13 9 17 33 63 40 66 50 54 28 21 18 39 64 45 38 111 0.48 F 29 R48C2-34-04 17 17 12 11 21 15 14 11 12 18 6 16 11 5 27 8 12 17 2 9 6 14 4 13 55 37 7 7 11 27 66 38 61 53 59 24 13 16 37 58 50 34 120 0.99 F 30 R48C2-5-109 4 10 9 4 15 1 5 -4 0 -1 8 8 -3 8 10 -1 5 7 6 10 3 10 2 0 44 25 8 21 33 13 18 0 4 61 71 24 57 71 32 34 6 13 3 0.27 unassigned 31 R48C2-5-13 21 29 62 44 79 62 1 -25 47 21 25 63 42 25 40 23 11 -6 -4 -3 -4 75 46 29 15 7 25 9 17 29 27 -6 2 28 35 13 156 139 19 -1 6 10 11 0.43 D 32 R48C2-5-14 25 44 70 54 86 70 19 -5 49 61 52 68 57 47 77 40 18 14 9 18 11 84 54 45 27 24 44 24 40 32 43 14 22 39 46 31 117 100 34 20 17 21 21 0.94 D 33 R48C2-5-01 96 46 84 79 114 101 39 21 89 155 44 80 72 51 170 42 29 28 7 7 5 84 67 60 78 39 34 44 61 34 16 7 8 73 96 35 72 96 40 46 9 12 15 0.70 unassigned 34 R48C1-67-18 14 65 110 85 117 126 -26 -40 110 201 57 93 88 63 219 52 72 94 57 32 106 97 84 79 65 -20 40 0 4 39 41 15 33 23 30 6 12 -3 24 4 9 15 11 0.63 unassigned 35 R48C1-67-89 30 44 96 47 75 91 39 23 53 96 42 69 65 54 104 33 79 85 55 25 32 77 59 59 41 18 33 -4 3 14 31 9 24 17 18 0 6 0 18 5 1 7 7 0.86 B 36 R48C1-67-33 48 50 89 64 84 91 41 32 61 88 57 82 72 63 94 46 67 84 68 48 64 81 70 72 66 38 47 2 9 26 42 15 36 30 34 13 11 5 33 12 10 15 15 0.96 B 37 R48C1-67-49 87 49 93 67 123 105 46 26 69 87 53 84 76 64 108 55 88 111 100 56 82 102 74 74 76 53 43 7 14 40 48 16 45 56 60 27 10 17 43 28 13 12 27 0.94 B 38 R48C1-67-90 72 43 80 76 100 89 38 23 76 78 44 73 68 53 86 44 77 87 80 42 57 79 64 56 69 39 37 8 16 47 59 35 53 43 44 21 11 8 39 27 16 17 25 0.96 B 39 R48C1-67-19 27 49 74 48 79 55 52 35 46 57 36 48 37 40 71 15 84 88 53 33 40 57 45 30 30 26 27 1 15 3 37 3 11 21 25 3 18 0 25 3 11 20 9 0.81 unassigned 40 R48C2-34-80 66 35 65 52 76 67 27 12 41 51 43 56 45 45 63 36 62 72 66 43 56 65 52 40 59 31 37 51 62 31 36 12 29 26 33 13 11 4 27 7 28 23 68 0.66 unassigned 41 R48C2-34-42 82 31 59 59 79 74 33 17 53 45 37 60 53 42 62 42 48 45 53 41 49 65 48 52 68 36 34 54 66 29 22 7 12 43 46 19 22 27 37 47 8 12 8 0.70 C 42 R48C2-34-75 73 20 48 51 71 62 26 14 38 35 30 47 44 33 52 31 34 33 42 30 39 53 38 40 64 32 27 47 62 21 13 2 5 39 43 16 17 18 32 43 4 6 4 0.99 C 43 R48C2-34-06 119 82 20 113 38 16 99 90 13 62 34 16 24 28 83 13 67 50 7 75 88 16 29 21 122 115 36 10 22 56 24 8 13 25 30 46 52 13 28 122 13 20 12 0.25 unassigned B au 図18:未分類の正規化されたin-tandemビニングデータをpvclustで分析す ることによる、43種類のDPEP1 モノクローナル抗体のパネルのクラスターグ 86 ラム。「Height」というクラスターグラムの左側の軸は、モノクローナル抗 体間の非類似性の尺度です。クラスターグラムでは、95のAU p値カットオフ 81 と0.2のHeightカットオフに基づいて、6つのクラスターが定義されていま 98 す。すべてのp値は灰色で表示されます。Liao-Chan et al. (Reference 4) を 60 基にした図です。 99 62 78 78 78 94 98 89 0.2 99 81 9 96 86 83 91 100 9 100 98 8774 8587 80 96 91 100 68 100 87 9 95 98 150096 8597 100 Cluster: E F A D B C 結論 References Octet HTXシステムは、高スループットのビニングアッセイを数時 1 Exploring Blocking Assays using Octet, ProteOn, and Biacore Biosensors, 間で実行できる強力なプラットフォームです。これは、96個の独立 Abdiche YN, et al ., Anal Biochem, 386, 172–180, 2009 . したビニング相互作用を並行してモニターできる非常に多用途のシ 2 Label-free Epitope Binning Assays of Monoclonal Antibodies Enable the ステムであり、96個の異なるモノクローナル抗体、抗原コーティン Identification of Antigen Heterogeneity, Abdiche YN, et al ., J Immunol Meth- ods, 382, 101–116, 2012 . グまたはバイオセンサー化学をまとめて測定し分類することを可能 にします。さらに個別のバイオセンサー測定により、すべてのモノ 3 High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-free Array-based Biosen- sors can Yield Exquisite Epitope Discrimination that Facilitates the Selection クローナル抗体を再生できるとは限らない一般的な再生条件ではな of Monoclonal Antibodies with Functional Activity, Abdiche YN, et al ., PLoS く、各モノクローナル抗体に応じて個別の再生ソリューションを調 One, 9(3):e92451, 2014 . 整できます。Octetプラットフォームはすべてのアッセイ形式に対 4 Monoclonal Antibody Binding-site Diversity Assessment with a Cell-based 応し、ユーザーはシングルアッセイでモノクローナル抗体の複数の Clustering Assay, Liao-Chan S, et al ., J Immunol Methods, 405, 1–14, 2014 . 組み合わせをテストできます。機器は最小限のユーザートレーニン 5 Epitope Binning of Murine Monoclonal Antibodies by a Multiplexed Pairing グで済み、 Octet Data Acquisitionソフトウェアで提供されるエピ Assay, Miller PL, et al ., J Immunol Methods, 365, 118–25, 2011 . トープビニングアッセイテンプレートにより、アッセイのセット 6 Pvclust: an R Package for Assessing the Uncertainty in Hierarchical Cluster- アップは容易です。これらのテンプレートは、より複雑なアッセイ ing, Suzuki R and Shimodaira H, Bioinformatics, 22, 1540–1542, 2006 . を開発するための優れた出発点となるでしょう。Octet Data Analysisソフトウェアの新機能により、データの視覚化とプレゼン テーションが容易になります。このソフトウェアでは、ユーザー指 定のレポートポイントでのnmシフトの計算、問題のあるデータへ のフラグ付け、生の結合データの正規化、さらなる分析のためにエ クスポートできる大きなビニングデータセットの2次元マトリック スの作成も可能です。高スループットと強力なソフトウェア機能を 備えたOctet HTXシステムは、エピトープビニング/クロス競合アッ セイの実施に最適なシステムであると言えます。 ザルトリウス・ジャパン株式会社 〒140-0001 東京都品川区北品川1-8-11 Tel: 03-6478-5200 Fax: 03-6478-5494 E-mail: fortebiojp@sartorius.com www.fortebio.com © 2020 Sartorius BioAnalytical Instruments, Inc. 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AN-4016_J Rev D Height 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 R48C2−5−04 R48C2−34−126 mAb2 \ mAb1 R48C2−34−30 R48C2−5−109 R48C2−34−04 R48C2−34−43 R48C2-34-69 R48C2−34−09 R48C2−34−69 R48C1−67−21 R48C1-67-20 R48C1−67−43 R48C2−5−12 R48C2-34-45 R48C1−67−03 R48C1−67−08 R48C1-67-53 R48C1−67−02 R48C1−67−34 R48C2−5−02 R48C1-67-40 R48C1−67−44 R48C2−34−08 R48C2-34-01 R48C1−67−88 R48C2−5−03 R48C1−67−37 R48C1-67-46 R48C1−67−09 R48C1−67−41 R48C1-67-08 R48C1−67−04 R48C1−67−53 R48C1-67-02 R48C1−67−20 R48C2−34−45 R48C1−67−46 R48C1-67-88 R48C1−67−40 R48C2−34−01 R48C2-5-03 R48C2−34−06 R48C2−5−13 R48C1-67-44 R48C2−5−14 R48C2−34−80 R48C1−67−18 R48C2-34-08 R48C1−67−19 R48C1−67−89 R48C2-5-02 R48C1−67−33 R48C1−67−90 R48C1-67-34 R48C1−67−49 R48C2−5−01 R48C2−34−42 R48C1-67-03 R48C2−34−75 R48C1-67-41 R48C1-67-09 R48C1-67-37 R48C1-67-43 R48C1-67-21 R48C1-67-04 R48C2-5-12 R48C2-34-09 R48C2-34-126 R48C2-34-30 R48C2-5-04 R48C2-34-43 R48C2-34-04 R48C2-5-109 R48C2-5-13 R48C2-5-14 R48C2-5-01 R48C1-67-18 R48C1-67-89 R48C1-67-33 R48C1-67-49 R48C1-67-90 R48C1-67-19 R48C2-34-80 R48C2-34-42 R48C2-34-75 R48C2-34-06 Pearson Full-pairwise biosensor cluster