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ホワイトペーパー『高度な細胞解析ソリューションによるウイルス生物学と宿主免疫に関する研究を加速する』

ホワイトペーパー

ウイルス感染、ウイルス複製、抗体反応 エピトープマッピング、免疫細胞活性、走化性、サイトカイン ストーム、細胞死、免疫細胞傷害性、NETosis

COVID-19、MERS-CoV、エボラなどの世界的なパンデミックをきっかけに、ウイルス学研究が注目を集め、科学者と一般市民の関心を一様に集めています。しかし、この「病原体集団」には、ウイルス生物学研究への投資拡大、迅速な発見を目的とした新しい科学的協力の確立、緊急の病原体が健康に長期的に影響を与えることについて一般市民が持つ関心が変わったことなど、プラスの側面もあります。

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このカタログについて

ドキュメント名 ホワイトペーパー『高度な細胞解析ソリューションによるウイルス生物学と宿主免疫に関する研究を加速する』
ドキュメント種別 ホワイトペーパー
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取り扱い企業 ザルトリウス・ジャパン株式会社 (この企業の取り扱いカタログ一覧)

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このカタログの内容

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White Paper June 24, 2020 キーワードまたはフレーズ: ウイルス感染、ウイルス複製、抗体反応 エピトープマッピング、免疫細胞活性、走化性、サイトカイン ストーム、細胞死、免疫細胞傷害性、NETosis 高度な細胞解析ソリューションによるウイルス生物学と 宿主免疫に関する研究を加速する Jill Granger, Product Management, Essen BioScience, Inc.―a Sartorius Company, 300 West Morgan Road, Ann Arbor, Michigan, 48108, USA 序論 COVID-19、MERS-CoV、エボラなどの世界的なパンデミックをきっかけに、ウイルス学研究が注目を集め、科学者と一般市民の関 心を一様に集めています。しかし、この「病原体集団」には、ウイルス生物学研究への投資拡大、迅速な発見を目的とした新しい科 学的協力の確立、緊急の病原体が健康に長期的に影響を与えることについて一般市民が持つ関心が変わったことなど、プラスの 側面もあります。 このような認識が高まると、治療の特定とワクチンの開発のため、早急にウイルス生物学と宿主免疫反応を特徴付ける必要があ ります。緊急の病原体に対して迅速かつ効果的に対応するためには、ハイスループットな実験的アプローチと、科学的に厳密で再 現性のある結果を導き出すための徹底的な解析をバランスよく行う必要があります。従来のエンドポイントでの評価には限界があ ります。複数の機器を用いて時間がかかる、うんざりするような「実践的」ワークフローを利用しており、病原体への曝露が増加する ので安全性にも懸念があります。これらのアッセイの実験的操作では、環境変動および対照の欠如が生じ、宿主の生理機能が真 に表されません。従来のエンドポイントアッセイは、ウイルス生物学および免疫反応について空間的、時間的な情報が欠如してお り、また、限られたサンプルおよび試薬がすぐに消費されます。複数の装置およびソフトウェアが必要となり、これによりばらつきを 生じる可能性があります。まとめると、従来の解析アッセイには、結果が得られるまで時間がかかる、動力学的情報がない、現行 ワークフローに課題がある(ペースの速い治療スクリーニングおよびワクチン開発にとって問題である)という障害があります。こ れは、結果が得られるまでの時間が重要な意味を持つ新規感染症においては特に重要ですが、再生医療における治療薬や腫瘍 溶解性ウイルスを用いたがんワクチンの開発など、他のトランスレーショナルなウイルス研究活動を妨げる可能性があります。 詳細:www.sartorius.com/incucyte
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Incucyte®生細胞解析システムおよびiQue® 3ハイスループッ トフローサイトメトリーではこれらの課題の多くを解決し、ウイ ルス生物学および宿主免疫反応研究の迅速かつ包括的で、洞 高度な細胞解析では、宿主-病 察力のある解析を提供します。これらの装置は、自動化され、 用途に柔軟性があり、再現性を持ってウイルス感染と免疫反 原体の生活環を介してウイルス 応の動態を迅速に解析するのに必要な処理能力を備え、新た 生物学と宿主免疫反応について な洞察をもたらします。 新しい洞察を示します。 Incucyte®は自動画像取得および解析を取り入れています。ま た、生理学的制御を改善するため、インキュベーターを使用し て生理的状態を維持し、数時間、数日、または数週間、リアル タイムで動的変化を定量化します。システムの柔軟性のある 用途、多重化能力、非侵襲的な試薬、統合された使いやすいソ 式のソフトウェアにより時間が節約され、大規模データセット フトウェアにより、生理学的に関連する環境で細胞の健康状 のスクリーニングに理想的に適したプレートレベルの注釈、 態、機能、移動、形態を迅速に評価でき、リモートアクセスを介 分析、および結果視覚化ツールが提供されます。線形範囲の してオペレーターの病原体への曝露を最小限にします。 データにアクセスして、アッセイの性能について理解を深める こともできます。ウェルから得たそれぞれのデータは一緒に関 iQue ® 3は自動化されたハイスループットのフローサイト 連付けられ、複数のアッセイの結果を組み合わせて「ヒット」 メトリーで、多重タンパク質解析と免疫表現型検査を迅 の特定を促すことができます。 速に実施し、機能的評価を行うことができます。免疫細胞 の活性化を評価し、機能的プロファイリングおよび抗体ス 以下の研究では、I n c u c y te ® L i ve - C e l l分析とi Q u e ® 3 クリーニングを実施できます。iQue ® T細胞表現型キット、 Advanced High-Throughput Flow Cytometryがどのように サイトカインストーム評価用ヒトQbeads®炎症検査、およびT してウイルス学のワークフローに組み込まれ、迅速な分析ソ 細胞活性化、記憶、キリング、および疲弊評価用のキットなど リューション、簡略化、スループットの向上を実現したかにつ の便利な既製キットと、各サンプルの宿主免疫反応をさらに いての実例を紹介しています。さらに、感染後、これらのプ 詳細に特徴付けするサイトカインプロファイリングパネルを備 ラットフォームは、曝露の監視、免疫防御の評価、抗ウイルス えています。プラットフォームはほんの少しのサンプル量しか 低分子、中和抗体、ワクチンの開発を促進するために使用さ 必要とせず、試薬が節約されるため、小型化が可能です。プロ れています。 ファイリングおよび薬理学スクリーニングにおいてハイスルー プット解析を数分で行うための384ウェルを含め、様々なマ イクロプレートに対応します。研究者は、統合された使いやす いForecyt®ソフトウェアを使用して、再現性のあるハイスルー プットトラッキングおよび解析を行うことができます。この最新 2
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宿主の感染とウイルス複製 宿主-病原体の生活環には、ウイルスの融合、侵入、複製、 拡散などの一連の動的事象が関与します。このような初期 事象(感染率および複製率など)の動的生物学を理解する ことにより、治療標的、中和抗体、ワクチンの特定において 重要な手がかりを得ることができます。 ウイルス感染モデルの選択と開発 ウイルス学の研究において重要な第一段階は、生物学的 および臨床的に関連する適切なモデルの選択です。 Robertsら(2017)はチクングンヤ熱ウイルス(CHIKV)の感 染サイクルのin vivoモデルとして最も生理的に関連するも のを特定するために細胞株を評価しました1。Incucyte®生 細胞イメージングおよび解析を用い、分化時の細胞形態 の明視野画像を捉え、インキュベーターを使用した生理的 に安定する環境でin vivo条件を再現しました。C2C12(筋 芽細胞)およびHuh7(肝細胞)分化時の形態変化を可視化 しました。C2C12細胞は、インビトロで血清飢餓状態により ウイルスの侵入と感染 分化し、インビトロでの筋肉組織と同様の筋管を形成した。 これは、CHIKV RNA複製の増加とも関連していました。 ウイルスの侵入と感染を特徴付けることにより、治療標的の DMSOにより分化したHuh7細胞は、成長停止および肝タン 特定またはワクチン開発に利用可能な情報を得ることができ パク質のアップレギュレーションを受け、未分化細胞と比較 ます。Steinら(2019)は、治療標的を特定するため、ヒト網膜色 してCHIKV RNA複製レベルの低下を示します。これにより、 素上皮細胞表面タンパク質(ARPE)に対するモノクローナル 生細胞解析から得た形態情報を生物学的理解に加えるこ 抗体のライブラリーを用い、ヒトサイトメガロウイルス(CMV) とがいかに重要であるが示されました。 の宿主細胞への侵入を検討しました3。マウスにARPE-19由来 膜画分を注入し、免疫を付与された血清を生成し、iQue®ハイ ウイルスを安全に扱うことができるように新しい感染モデル スループットフローサイトメトリーを使用してARPE-19細胞表 の開発が必要と考えられます。特に毒性ウイルスに安全に 面タンパク質に対する抗体を解析しました。ウイルス抑制アッ 対応できるBSL-4施設の利用が限られており、これにより研 セイでは、2種類のクローンを同定しました。これらのクローン 究の進歩が妨げられる可能性があります。Xiaoら(2018) は、線維芽細胞への侵入を抑制しますが、遮断することはでき は、エボラ細胞の侵入を模倣できるシングルサイクルウイル ませんでした。その後の実験から、著者らはCD46ウイルスの スである、偽型エボラウイルス(E-S-FLU)を開発しました。 侵入が結合後の事象に依存すると提案しました。CD46はそ これは、BSL1/2封じ込め施設で安全に取り扱うことができ こでCMV PCと相互作用します。CD-46 KO上皮細胞を用い ます2。E-S-FLUウイルスはインフルエンザウイルスを用いて た研究では、CMV拡散の減少が示され、CD46依存性のプロ 作成され、エボラウイルスの糖タンパク質(EBOV-GP)で覆 セスがウイルスの拡大に関与することを示しています。さら われています。E-S-FLUは緑色蛍光レポーターをコードし、 に、転写プロファイルにおける操作の必要がない、トランス インフルエンザの血球凝集素(HA)遺伝子を置き換えまし フェクションおよび形質導入の毒性作用がない、アッセイを柔 た。レンチウイルスベクターを用いてMDCK-SIAT1細胞を形 軟にカスタマイズできるなど、遺伝子スクリーニングにこの 質導入し、安定して高レベルのEBOV-GP(E-SIAT)を発現 mABライブラリーアプローチを用いる利点を説明しました。 させました。E-S-FLUウイルス力価評価の一環として、 Incucyte®を用いて3時間間隔でプラークの画像を取得し、 感染動態中の重要な形態学的情報を明らかにしました。 E-SIAT細胞は小さなびまん性プラークを形成しましたが、 H5-SIAT細胞はより濃いプラークを生成しました。偽型E-S- FLUウイルスの単一生産ロットを活用し、ウイルスの侵入を 抑制するため、BSL1/2として1280化合物のライブラリーをス クリーニングしました。 3
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生細胞イメージングおよび解析を使用して処理細胞の蛍光レ 位を阻害することが判明された。ZIKVに感染されたVero細胞 ポーターからのシグナルをモニタリングすることによりウイルス をCDDO-meまたはZIKV中和血清で処理し、Incucyte®によ の感染および侵入を研究することもできます。Quiら(2018)は り時間経過に伴うパーセンテージコンフルエンスを計算して、 エボラウイルス(EBOV)糖タンパク質とNiemann-Pick C1 感染の細胞病理効果を決定した。CCDO-me(0.13μM)は、 (NCP1)との相互作用を研究し、EBOVのNCP1への輸送およ 5%のZIKV中和抗血清と同様に、Zikaに感染したVero細胞を び送達に関する洞察を得ました4。Incucyte®生細胞イメージン 保護した。CDDO-meとPU-WS13(grp94阻害剤)も抗フラビ グおよび解析を用い、GFP+ fociの視覚化により、EBOV ΔM ウイルス活性を有しており、grp94の阻害はDENVとZIKVの両 GPまたはVSV Gを内包するGFP発現MLV偽型がArPIKfyveお 方に対するCCCO-me阻害に関与している可能性がある。 よびSac3 KO細胞に侵入することを捉えました。追加解析で、 Herodら(2019)は、口蹄疫(FMDV)および馬鼻炎ウイルス EBOVの侵入にはPAS複合体のすべてのサブユニットが必要で (ERAV)に対する抗インフルエンザ薬Arbido(l ARB)の効果を あり、NPC1の効率的な送達を促すにはPtdIns (3, 5) Pの細胞 研究するために、ライブセルイメージングおよび解析を用いて 生産が必要であることが分かりました。これらの結果は、この GFPレポーター遺伝子発現を検出した6。FMDVレプリケー 毒性病原体の感染および侵入に新たな光を当てました。 ションアッセイのレプリコンを用いて、BSL2レベルの封じ込め レベルでのウイルス複製を研究することができた。BHK-21細 胞をDMSO、GuHCl、またはARBで処理し、野生型GFP ウイルス複製 FMDVレプリコンをトランスフェクトした。蛍光レポーター蛋 白質の発現をIncucyte®を用いて10時間モニターしたところ、 ウイルスの侵入に加え、これらのプラットフォームは、ウイルス ARB処理によりFMDV複製の用量依存的な抑制が得られた 複製の分野でも、治療の開発に新しい洞察をもたらします。 ことが明らかになった。その後の解析の結果、ARBはFMDV Rothanら(2019)は、デング熱ウイルス(DENV)およびジカウ RNAサブゲノムレプリコンの複製を阻害し、ピコルナウイルス イルス(ZIKV)感染のウイルス病原体を標的とした別のアプ ゲノムの複製を阻害する可能性が示唆された。 ローチとして宿主細胞の成分を用いた研究を行いました5。生 細胞解析を用い、バルドキソロンメチル(CDDO-me)で処理 あるいはZIKV中和抗血清で中和されたZIKA感染および DENV感染ベロ細胞をリアルタイムで増殖能を定量化しまし た。CDDO-meは、宿主因子grp94を標的とする可能性がある Hrd1ユビキチンリガーゼ媒介ERAD経路の阻害剤であり、転 位を阻害することが判明された。ZIKVに感染されたVero細胞 をCDDO-meまたはZIKV中和血清で処理し、Incucyte®により 時間経過に伴うパーセンテージコンフルエンスを計算して、感 染の細胞病理効果を決定した。CCDO-me(0.13μM)は、5% のCDDO-meは、宿主因子grp94を標的とする可能性がある Hrd1ユビキチンリガーゼ媒介ERAD経路の阻害剤であり、転 4
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ウイルスの伝播 ウイルスの複製に加えて、ライブセル解析は、ウイルスの伝達 と拡散に関する新たな洞察を与えます。麻疹ウイルス(MeV) の場合、ウイルスエンベロープのF-およびH-糖タンパク質を 発現する感染細胞と未感染細胞が融合した際に、ウイルスは 合胞を形成することができる。モルビリウイルスの一種である MeVは、ウイルスの出芽によっても拡散する可能性がある。 Kellyら(2019)は、ライブセル解析を用いて、転写ユニットとし てGFP蛍光タンパク質を発現する組換え型MeVを用いて、麻 疹ウイルス(MeV)の細胞間伝播を研究した7。これらの所見 GFP(緑色)レポーターを含む口蹄疫ウイルス(FMDV)レプリコンを形質移 は、ウエスタンブロットで検出されたMeVのヌクレロカプシド 入したBHK-21細胞。Incucyte®生細胞イメージングおよび解析を用い、経時 (N)、FおよびHタンパク質の減少とも一致していました。 的なウイルス複製の指標としてGFP(緑色)レポーターを発現した細胞をリ BST2が細胞融合(シンシア形成の減少として可視化された) アルタイムで映像化した。典型的なウェルを1時間ごとにGFP(緑色)発現に ついて映像化し、動画を編集してFMDV複製を示した。データは および細胞間の拡散を阻害することを決定づけるために Morgan Herod博士(リード大学)の厚意により提供された。 Incucyte®、免疫標識および生化学を用いた追加分析を使用 しました。 ウイルスの伝播に関する研究のもう一つの重要なポイントは、 ウイルスの分散です。ウイルスは、宿主細胞に感染する複数の バイロン集合体を介して分散されます。Anderu-Morenoと このトピックに関する追加情報 Sajuan(2018)は、遊離小胞性口内炎ウイルス(VSV)粒子と唾 については、Fiona Tulloch博士の 液中に凝集した粒子のウイルスフィットネスを研究した8。この 研究では、Incucyte®を用いたリアルタイムのライブセルイメー 「Fu r t h e r i n g I n s i g h t a n d ジングおよび解析の動的性能を活用して、凝集形態で分散し Productivity in Cell Biology たウイルス粒子と単分散形態で分散した粒子のフィットネス効 果を比較した。リアルタイムのライブセル動態研究により、ヒト with Real-Time Quantitative 唾液を用いて単分散VSV-mCherry粒子または凝集VSV-GFP Live-Cell Analysis(リアルタイム のどちらかを接種したマウス胚性線維芽細胞(MEFs)を検討 した。Incucyte®による分析から生成された成長曲線は、単分 の定量的生細胞解析による 散したものと比較して、凝集体で形成されたウイルス集団が左 細胞生物学のさらなる洞察と生 方向にシフトしていることを明らかにした。ウイルス粒子の凝 産性)」についてのウェビナーを 集は、短期的なフィットネスの優位性を与え、ウイルスの子孫 の放出を増加させたが、これは感染に対する細胞の寛容性に ご覧ください。 依存し、細胞の自然免疫のレベルと相関していた。 5
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宿主免疫反応 抗体反応とエピトープマッピング 先天的免疫反応の活性化に加え、適応免疫系はウイルス防 ウイルス生物学は単離状態では起こりませんが、宿主免疫反 御を目的として抗体を産生します。ウイルス抗原のエピトープ 応の作用を受けます。これは、病原体を検出し、戦い、排除す マッピングは初期反応研究の重要な特徴付けであり、ハイス る過程においてバランスが変化する先天性免疫系と適応免疫 ループットフローサイトメトリーはそのような調査を理想的に 系の間の微妙な相互作用のことを言います。この反応の動態 補助します。Williamsonら(2019)の洞察力に富んだ研究で および程度は、個々の遺伝子と炎症状態、およびウイルス突 は、エボラ感染症の生存者の回復初期のメモリーB細胞を分 然変異のシフトによって複雑化されています。動力学的かつ包 析しました11。感染後1~3カ月の生存者からメモリーB細胞の 括的な解析により、動的でしばしば複雑化されるこの事案の モノクローナル抗体(mAb)を単離し、エボラ特異的B細胞の タイミングと程度について重要な情報を見いだす可能性があ 頻度を検討しました。エピトープマッピングのアラニンスキャ ります。細胞の健康状態、機能、表現型、活性の変化、および感 ンニング変異導入法の一環として、iQue®フローサイトメト 染過程で周期的に生産される前炎症性および抗炎症性メ リーを用いました。エボラ糖タンパク質(EBOV GP)について ディエーターには、ウイルス-免疫系相互作用と治療候補に アラニン走査突然変異誘発ライブラリーを作成し、アラニンス 対する反応に関する重要な情報が含まれています。 キャンニング変異導入ライブラリークローンを作成しました。 このライブラリーをHEK-293T細胞に形質移入し、突然変異 GPを発現させ、フローサイトメトリーを目的とし、EBVOV237 免疫細胞の活性化 のFabフラグメントと二次Alexa Fluor 488共役抗体を用いて、 細胞を固定し染色しました。iQue®を細胞蛍光解析に用いま ウイルス曝露は、病原体排除のための免疫細胞の活性化と持 した。EBOV237 Fabフラグメントの突然変異に対する反応性 続的応答を開始する。Zanderら(2019)は、慢性感染や癌にお を野生型EBOV GPΔムチンと比較しました。変異体に対する いて、CD4+ T細胞がどのように疲弊したCD8+ T細胞を持続さ EBOV237Fabフラグメントの反応性を、野生型EBOV GPΔ せるのかの研究した9。著者らは、リンパ球性絨毛膜炎ウイルス mucinと比較しました。変異体に対するEBOV237Fabフラグ (LCMV)のGP33-41ペプチドに特異的なCD8+ T細胞の機能評 メントの反応性を、野生型EBOV GPΔmucinと比較しました。 価を行った。選別されたGP33-41 CD8+T細胞のサブセットを、 EBOV237 Fabフラグメントには結合しなかったが、他の対照 GP22ペプチドあるいは対照ペプチドで処理した標的EL4細胞 EBOV mAbsに結合したクローンを、対象クローンとみなしま と共培養した。著者らは、CD8+T細胞の細胞毒性を定量するた した。その後の分析により、EBOV237として指定されたmAB めに、Incucyte® S3およびIncucyte® Annexin V Red Reagent によって認識される表面糖タンパク質のグリカンキャップ内 を使用した。追加のscRNA-seq解析と転写プロファイリングを の中和エピトープが同定されなした。このエピトープは、エボ 用いて、CX3CR1+を発現するCD8+ T細胞サブセットは、ウイル ラウイルスに対する初期応答において重要な役割を果たして ス制御の鍵となる細胞溶解機能を有することを発見した。これ いる可能性があり、潜在的なワクチン候補となる可能性があ は、CD4+ T細胞から産生されるIL-21にも依存していた。 ります。 別のCD4+ T細胞研究では、免疫クリアランスからのHIV-1の アラニン突然変異誘発を用いた別の研究では、Collinsら 潜在性および回避をさらに理解するために、Kwonら(2020) (2019)がジカウイルス感染に対するヒトB細胞抗体反応を研 が休止期ヒトメモリーCD4+ T細胞サブセットの潜在的HIV-1 究しました12。保護抗体を有するSIKV患者から2つの型特異的 プロウイルスを検討しました10。複数の刺激ウイルス増殖アッ mAbを単離し、ウイルスエピトープのマッピングに用いまし セイを用い、抗レトロウイルス療法に対してHIV-1患者のナ た。アラニンスキャンニング変異導入を行い、ZIKV E突然変異 イーブおよびメモリーT細胞(セントラル、トランジショナル、エ を発現した細胞のマッピングを用いて、ZIKV prM | Eslaninス フェクター)を検討しました。iQue® Screener Plusを用い、休 キャンライブラリーを作成しました。iQue®フローサイトメト 止期のCD+4 T細胞サブセットの細胞活性化レベルを評価し、 リーの処理量により、エピトープマッピングの平均細胞蛍光 ウイルスを増殖させるために必要なサブセットと一連の刺激 を迅速に評価できます。血漿抗体およびメモリーB細胞反応 との間に相関は認められませんでした。追加解析では、T細胞 がZIKV型特異的であると結論付けました。中和抗体は主に サブセットでは未変化または誘導性プロウイルスの濃縮がな ウイルスエンベロープ上の4次構造エピトープを標的として いことが明らかとなり、HIV-1療法におけるT細胞メモリーサブ おり、著者らはDENVや他のフラビウイルスにも見られること セットを探究することの複雑さが浮き彫りとなりました。 を指摘している。長寿命の中和抗体反応を生じる標的の特定 が有用であり、抗原デザインおよびワクチンにより生成され た免疫の誘導に使用できることが強調されています。 6
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細胞死 別のNETosis研究では、Chirivi博士、Raatsら(ModiQuest B.V.)が炎症時に細胞外環境にNETが放出されることを報告 細胞死メカニズムの動態を理解することにより、ウイルスに感 しました14。Incucyte®生細胞イメージングおよび解析を用い 染した細胞の免疫細胞傷害性および細胞死メカニズムを理 て、組み換え治療用抗環状シトルリン化タンパク質抗体 解することに対する、有益かつ未知の洞察を得ることができ、 (tACPA)存在下、好中球からのNET放出を捉え、いずれも 新たな治療標的を特定することができます。 NETの病状に伴う炎症性疾患の治療および予防的可能性が 示されました。細胞外空間へのNET放出に干渉することが初 ウイルス疾患で注目を集めた細胞死の1つはNETosisです。 めて報告されました。 Barr、Roderiguez-Garciaらによる革新的研究では、HIV感染 に対する防御機構として生殖器粘膜の好中球によるNETosis NETosisに加え、アポトーシスからも細胞死が生じる可能性が の形成を特定しました。これは、HIV感染の初期段階ではこ あります。Brownら(2018)は、家禽のウイルス感染に関与する れまで未発表の所見でした13。Incucyte®生細胞イメージング 重要なタンパク質として、マレック病ウイルス(MDV)のMeqと および解析では、ヒト生殖器の好中球により内包された、 鶏貧血ウイルス(CAV)のアポプチンタンパク質の相互作用を GFPで標識されたHIV-VLP(HIVウイルス様粒子)のin vitro 検討しました15。Incucyte®生細胞イメージングおよび解析と 動態を捉えました(図1)。NETはウイルス感染から数分以内 Incucyte® Caspase-3/7アポトーシス試薬を用い、形質移入し に放出されました。 た鶏線維芽細胞(DF-1)のアポトーシスにおいてMeqアポプチ ン相互作用の機能的、動力学的効果を研究しました。 A. B. Meqタンパク質はアポプチンを阻害しました。これはCAVワク チン産生に重要な意味を持つ可能性があります。 Cubas-Gaonaら(2018)は、感染性ファブリーキウス嚢病 (IBDV)におけるIgM Bリンパ球の消失およびIBDV感染にお ける1型インターフェロン(IFN)の役割を検討しました16。生細 胞解析を用い、IFN-αを処理し、IBDVおよびDF-1細胞を感染 させたHeLa細胞のアポトーシス亢進を検討しました。本研究 では、IFN-αに曝露した場合、IBDV感染細胞が著しいアポ トーシスを受けることを証明しました。 細胞死の第3のメカニズムはネクロトーシスです。ウイルスは C. D. このメカニズムを利用して感染を促し、破壊を回避します。 Reddyら(2020)は、鶏B細胞が死滅した際のBcl-2関連タン パク質であるNr-13の役割を検討しました17。シチメンチョウヘ ルペスウイルス(HVT)VNR-13はαヘルペスウイルスコード化 B c l - 2ホモログであり、実験室で作成した突然変異体 (HVT-ΔvNr-13)を用い、VNr-13の機能的役割を検討しまし た。生細胞解析を用い、HVT vNr-13形質移入細胞に感染した DF-1細胞のアポトーシスをモニタリングし、ウイルス複製の後 半では、HVT vNr-13が、PFUの増加に加えて細胞アポトーシス の抑制に関与することが示されました。HVTは感染した細胞 のアポトーシスを遮断しますが、感染していない周囲の細胞 図1:NET形態を誘導するため、非透過性DNA色素(赤色)で培養し、GFPで ではアポトーシスが活性化することも分かりました。 標識されたHIVウイルス様粒子(緑色)で刺激した女性生殖管から単離した 好中球。(A)はNET(赤色)で染色したDNAを示す。(B)はNETに内包された GFPで標識されたウイルス様粒子を示す。左下図(C)は位相差を示し、NET も視覚化することができる。右下図(D)はNETに内包されたHIVとの融合を 示す(黄色で表示)。画像はMarta Rodriquez-Garcia博士(タフツ医科大学) の厚意により提供された。 7
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走化性 遊走阻止因子)の生態に関する興味深い話があります。MIF は、アポトーシスの抑制、マクロファージの活性化、NLRP3イ 細胞死に加え、感染時には走化性がアップレギュレートされ ンフラマソームの刺激など、様々な方法により先天性免疫応 ます。生細胞解析は、創薬スクリーニングに関する走化性研究 答を調節することができます。Karsten(2017)は博士課程の研 のハイスループット動力学測定に適しています。C h e nら 究において、炎症性サイトカインシグナル伝達における赤血 (2018)は、治療標的の特定、作用機序研究、安全性評価に免 球細胞の役割を特徴付けました20。Incucyte®生細胞解析を用 疫細胞の生細胞走化性解析を利用しました18。Incucyte®走化 い、赤血球と共培養したA549細胞株の細胞の増殖率および 性アッセイにより、ハイスループットで足場を形成された表面 コンフルエンスを検討しました。ここでは、赤血球細胞の溶解 の細孔をどれだけ通過したかを定量化できます。また、細孔を 物へのサイトカイン放出も認められました。初回抗原刺激を 通りぬける前に、細胞の水平移動を自動的にモニタリングで 受けた赤血球はT細胞の増殖と活性化を刺激することができ きます。これには、プロセス中の形態変化を捉えられるという ます。Karstenは、MIFのみならず、他のエフェクタータンパク質 付加価値もあります。SalyerおよびDavid(2017)は、安全で有 の貯蔵庫としても機能する赤血球細胞を認め、赤血球細胞が 効性のあるワクチンアジュバントの開発を支援するため、走化 バッファーとして機能し、サイトカインを結合、放出して別の免 性アッセイを利用しました19。炎症および骨髄系関連モジュー 疫細胞活性に影響することを裏付けています。S m i t hら ルと関連したTLR含有アジュバントに焦点を当てて構造-活 (2019)は、後にウイルス感染時のマクロファージの制御につ 性相関を検討し、適切なワクチンアジュバントとして使用する いて理解するため、インフルエンザ(IAV、PR8株)のマウスモデ 先天性免疫刺激分子のトランスクリプトームシグネチャを特 ルにおけるMIFの役割を検討しました。インフルエンザに感染 定しました。Incucyte®生細胞イメージングおよび解析を使用 したMIF欠乏マウスは、野生型の対照と比較し、炎症が少な して、段階的濃度のTLR作用薬で処理したHFF(ヒト包皮線維 く、ウイルス量が減少し、死亡率が低くなっています21。MIFは 芽細胞)を用いてPBMC走化性を評価しました。TKR2/6作用 肺空間の炎症を亢進し、感染時に肺の透過性を上昇させまし 薬で刺激したHFFはPBMCのリンパ球で機能的走化性反応 た。肺胞上皮でMIFを過剰発現したマウスは、炎症が多く、ウ を示しましたが、TlR1/2は反応を示しませんでした。 イルス量が増加し、死亡率が高くなっていました。Incucyte®生 細胞イメージングおよび解析およびIncucyte®アポトーシス試 薬Caspase-3/7およびAnnexin-Vによる細胞毒性アッセイお よびアポトーシスアッセイを用い、IAV感染マウスから採取し たGFPで標識された気管支肺胞洗浄(BAL)細胞におけるIAV ウイルス複製と細胞生存率を評価しました(図2)。この解析は MIFによるウイルスの拡散を解明するのに役立ちました。 in vitroで組み換えヒトMIFを処理したヒト肺上皮培養では、イ ンフルエンザウイルス感染細胞の数が増加していることが示 されました。MIFは、検討したモデルで宿主の抗ウイルス免疫 反応を低下させ、インフルエンザ感染時の炎症プロセスを増 大させるという結論が出ました。この所見により、この重要な サイトカインの生態、関連する病状、感染しやすい患者で発生 しうる不適切なアップレギュレーションの作用などの疑問が 投げかけられています。 Incucyte®走化性アッセイの動画(例) 免疫エフェクター反応は有益と考えられますが炎症活動と抗 炎症活動の免疫バランスが異常調節されると、宿主の悪影響 サイトカイン、ケモカイン、サイトカインストーム 上述のとおり、サイトカインおよびケモカインタンパク質の産 生は、ウイルス感染に対する宿主免疫反応の重要な指標にな り得ます。この重要なエフェクタータンパク質の生態、このタン パク質を産生する細胞、その放出の動力学、機能的作用を理 解することで、免疫系の活性およびウイルス感染の基礎病理 に新たな光を当てることができます。 図2:ヒト組み換えマクロファージ遊走阻止因子(MIF)を処理 適切な例として、疾患およびウイルス感染に対する免疫反応 した、インフルエンザA(PR8)を感染させたCalu-3-lunがん細 に関して言えば、前炎症性サイトカインMIF(マクロファージ 胞。生存度評価を目的として、Incucyte® Annexin Vを使用し た。画像はDr. Candice Smithの厚意により提供された。 8
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が及ぶ可能性があります。ウイルス感染および細菌感染に対 抗体力価に加え、生細胞解析を用いてウイルス感染後の増殖 する反応において、最も解明が進んでいるのは、サイトカイン と創傷修復を評価できます。これは既存の宿主生理機能と関 ストームおよび急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の展開です。 連している可能性があります。Anderssonら(2020)は、重度 Hillyerら(2017)は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染時のIFN 治療抵抗性喘息(TRA)の小児および就学前児童の喘鳴 (インターフェロン)と炎症性サイトカインのバランスと、これ (PSW)における、RSV感染後の気道上皮細胞創傷治癒障害 がいかにウイルス複製を制限し、疾患重症度に影響を与える について検討しました26。Incucyte®解析を利用し、ハウスダス かを調査しました22。Incucyte®解析を用い、ウイルス感染の動 トマイトアレルゲン(HDM)とTLR3作用薬ds RNA poly I:Cお 画とともに、rgRSV感染A549(肺胞)細胞およびREAS-2B(気 よびIL-33に対する重度PSWおよびSTRA患者から単離した 管支)細胞におけるウイルス拡散を評価しました。転写因子お PBEC(一次気管支上皮細胞および生検)曝露後の、気道上皮 よびパターン認識受容体のウエスタンブロットとともに、細胞 細胞の増殖および擦過傷の修復を評価しました。PSWの小児 上清のサイトカインを評価しました。A549細胞は容易に感染 は気道上皮増殖反応および創傷治癒の異常を示し、 し、前炎症性反応に特徴的な遺伝子を発現することが分かり ウイルス感染に対する宿主反応への反応性気道の影響を証 ました。さらに、BEAS-2B細胞の感染細胞には小さな病巣が 明しました。 あり、抗ウイルスインターフェロン刺激遺伝子(I型およびII型) およびパターン認識受容体が多く発現しました。これらの洞察 は、確立された細胞の抗ウイルス状態の役割と感染への異な る反応様式を重要視しています。 感染後の解析と予防免疫 感染後に関する研究は、感染の程度および考えられる持続的 免疫の評価において重要な要素です。これらは両方の病原性 ウイルスに当てはまり、治療の目的でデザインされました。抗 体力価、免疫細胞の記憶と疲弊、宿主組織に対する作用に関 する血清学研究により、宿主への感染の長期的影響に関する 重要な情報を得ることができます。 感染後の血清学研究では、保護抗体に関するたくさんの情報 が提供されています。Xuら(2016)は、急性デング熱ウイルス感 染時の既往抗体による免疫保護を研究しました23。DENVのヘ テロ血清型の症候性再感染後の既往反応について、デング熱 ウイルスに異種二次感染した患者検体からクローニングした 抗体を評価しました。二次感染直後、ヒト形質芽球によりデン グ抗体が生成されました。ショットガン突然変異誘発エピトー プマッピング時に、iQue®ハイスループットフローサイトメト リーを用い、突然変異クローンに対する抗体反応性を検証し ました。in vitroにおける中和やin vivoマウスモデルにおけるウ イルス血症の減少にもかかわらず、保護的な交差反応性既往 抗体反応がありました。Niuら(2019)は、ジカウイルス(ZIKV) に感染した回復期の患者の抗体反応を検討し、3つのmAb(ウ イルスを中和する最も強力なZIKVエンベロープタンパク質に 結合)を単離しました24。iQue®を用い、抗体のエピトープマッ ピングを実施しました。致死量のZIKVをSCIDマウスに投与し たところ、抗体による保護が行われました。 Stewartら(2014)はIncucyte®解析の利用について報告し、感染 Huh-7細胞のC型肝炎ウイルス(HCV)力価を決定しました25。感 染細胞を計数し、ソフトウェアを利用してレポーター遺伝子を 発現させずに力価を外挿しました。これは1ミリリットル当たり の感染単位数(IU/mL)として示しました。他の方法と比較し たところ、この方法により、コスト、時間、誤差が減少し、正確 度、精度、再現性が向上しました。さらに、検出範囲も広く直線 的なので、ハイスループットの抗ウイルス化合物スクリーニン グに最適です。 9
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治療薬とワクチンの開発 これとは別に、Andreas Pichlmair博士の研究室では、 Stukalovら(2020)がSARS-CoV-2およびSARS-CoVに関 する研究を行い、多段階のプロテオミクスアプローチを用 新しいウイルス感染が発生すると、初期段階では、既存薬の い、SARS-CoV-2およびSARS-CoVによる宿主の摂動を検 転用に焦点を当てて治療薬の探索が行われます。例えば、 討しました30。bioRxivのプレプリントでは、この評価の一環 COVID-19の初期段階では、研究のためにクロロキン(CQ) として、生細胞イメージングおよび解析を利用し、既存の薬 およびヒドロキシクロロキン(HCQ)が使用されました。 物を用いた抗ウイルス療法の標的とすることができる、 bioRxivのプレプリントでは、Yangら(2020)が細胞株におけ SARS-CoV-2の脆弱性を検証しました。SARS-CoV-2が複 るクロロキン(CQ)とヒドロキシクロロキン(HCQ)の効果に 数の段階で様々な宿主の経路を混乱させることが分かり ついて報告し、リスク予想に対する生理学に基づく動力学モ ました。ウイルス抑制アッセイの一環として、Incucyte®生細 デル(PBPK)の細胞毒性と評価を検討しました。Incucyte® 胞イメージングおよび解析を用い、SARS-C0V-2 GFPレ 生細胞解析を用い、CQおよびHCQの細胞毒性評価におい ポーターウイルス感染の経時的蛍光顕微鏡評価の一環と て細胞の生存度と増殖をモニタリングしました27。細胞毒性 して、阻害剤を処理し、SARS-CoV-2-GFPを感染させた がin vitroで時間依存性と用量依存性があることを認め、臨 A549-ACE2細胞の細胞生存度とウイルスの増殖を評価し 床的に投与する場合は、短時間の投与が適していることを ました。この薬物スクリーニングでは48種類の薬物を評価 示唆しました。 し、SARS-CoV-2により混乱した経路を調節し、抗ウイルス 療法候補を特定しました。Incucyte®を用いた生細胞イメー 既存のワクチンの要素は、開発の戦略として改変される可 ジングおよび解析で48時間以降のGFPシグナルと細胞増 能性があります。Behzadiら(2019)は、インフルエンザA型ワ クチンのプラットフォームを逆遺伝子工学により転用し、 CMVウイルスエンベロープタンパク質(gH)に対して中和 抗体を発現させました28。ここでは、iQue®ハイスループット フローサイトメトリーを用い、新しいヒトサイトメガロウイル ス(CMV)ワクチンをデザインするために、ウイルスエンベ ロープタンパク質の結合解析を行いました。Boudreauら (2020)は、血清学的にアプローチするシステムを利用して、 アジュバントのミョウバンとMF59を投与したH5N1鳥インフ ルエンザワクチンの接種を受けた患者とアジュバントなしの ワクチンを接種した患者の抗体機能プロフィールを評価し、 生じた免疫反応に対するMF59の効果を検討しました29。 iQue®ハイスループットフローサイトメトリーで読み込んだ ハイスループットなビーズベースのアッセイを用い、抗原特 異的抗体サブクラス-アイソタイプおよびFcR結合を判定し Incucyte® S3の動画。ワクチンは細胞のACE2受容体に結合するため、 ました。 SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現したワクチン候補を示す。赤色は 細胞のACE2受容体、緑色はワクチンのSpike-Sタンパク質を示す。黄色の 斑は、ACE2受容体とワクチンによる両細胞の同時局在化を示す。動画は また、Incucyte®生細胞イメージングおよび解析を使用して、 Humane Genomicsの厚意により提供された。 ワクチン候補が標的に結合したことを確認しました。右の動 画では、Humane Genomicsがこの技術を用い、標的細胞に 対するACE2受容体へのワクチン候補の結合を検討しまし た。動画では、細胞のACE2受容体(赤)が、ワクチンのSARS- CoV-2スパイクタンパク質(緑)と結合しているのが分かりま す。この結合は同時に局在する斑として黄色で表示されます。 この動画に関する詳細:https:// www.humanegenomics.com/ blog/update-on-covid19- vaccine/ 10
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殖の評価を利用し、経時的な細胞増殖率のヒートマップを 結論 作成しました。ギルテリチニブ、イパタセルチブ、プリノマス タット、およびマリマスタット化合物は抗ウイルス効果が最 も高く、SARS-CoV-2の複製を阻害するが、細胞増殖には ほとんど効果がないことが分かりました。 これらの研究は、ウイルス学の研究のためにIncucyte®生細 胞イメージングおよび解析プラットフォームおよびiQue®ハイ 新しい病原体のワクチン開発に加え、生細胞解析はオー スループットフローサイトメトリーを用いる価値を証明し、ウ ダーメイドのがんワクチンの開発に有用と考えられます。 イルス生物学と感染に対する宿主免疫反応に新しい洞察を Sahinら(2017)は、黒色腫に対するfirst-in-human治療とし 提供します。他の例については、以下の「A d d i t i o n a l て、RNAベースのポリエピトープを用いた個別化された Reading」をご覧ください。ハイスループットの性能、柔軟性 ミュータノームワクチンの開発について説明しました31。ネ のある用途、解析ソフトウェア、試薬、およびキットにより、各 オエピトープの計算による予測に沿って、個々の患者の変 サンプルから最小限の時間で収集したデータを迅速かつ包 異が包括的に特定しました。個々の突然変異状態に基づ 括的に、最大限に活用できます。さらに、これらのプラット き、カスタマイズされたワクチンを作成しました。Incucyte® フォームでは、サンプルも試薬も節約できます。ウイルスの生 システムおよびIncucyte® Caspase-3/7 Greenアポトーシス 活環の中で重要な動力学的事象、および宿主細胞の健康状 試薬を用い、in vitroでエフェクターT細胞と同時培養した黒 態、機能、表現型、活性、および免疫細胞反応に対する影響 色腫細胞のアポトーシスを評価し、ワクチンの特徴付けを は、少量のサンプルで自動的に評価され、再現性のある一貫 補助しました。Hassanzadehら(2019)はインターフェロン した実験結果を迅速に作成することができます。 感受性突然変異型マラバウイルス(MG1)を用い、腫瘍溶解 性ウイルスがどのように宿主免疫系と相互作用し、腫瘍を これらのプラットフォームを利用することで、急速に変化する 殺すかを解明しました32。Incucyte®生細胞イメージングお 公衆衛生問題と前臨床試験で求められる「スピードの必要 よび解析を用い、野生型およびS51マウス胎児線維芽細胞 性」と、再現性と信頼性を伴うウイルス生物学と免疫反応の (MEF)でGFPシグナルの密集度によるウイルスの伝播率 徹底的で定量的な解析との間の、かつてないほど重要なバ をモニタリングしました。Incucyte® Cytotox Red Reagent ランスを取ることができます。これらのツールは、解析を簡略 を用い、感染経過におけるモック感染細胞または感染細胞 化して処理量を増加することで、宿主-病原体の生活環を をモニタリングしました。このプラットフォームを用い、翻訳 通じて基本的研究と発見を加速できます。感染後、これらの 因子eIF5Bのノックダウンが細胞生存度とMG1の感染率に アッセイを利用して感染をモニタリングし、血清反応を迅速 与える影響も観察しました。 に特徴付け、ウイルス潜伏時の保護または研究を評価でき ます。抗ウイルス性小分子および中和抗体のスクリーニング に用いることもでき、新たなワクチン候補を特定し、開発する ためにも使用できます。Incucyte®およびiQue®のプラット フォームを実験解析に組み込むことで、宿主-病原体の生 活環における複雑な生物学的パズルの、長年探し求めてきた 「紛失したピース」を見つけることができます。ウイルス感染 は急速に出現し持続するため、すべてのピースが見つける必 要があります。 11
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Post-Infection Studies Development of Therapeutics and Vaccines See more about how these instruments were used for Explore more about how these instruments were used to post-infection studies, such as evaluation of neutralizing aid in the development of therapeutics and vaccines. antibodies. 1. Gilchuk P, et al.Analysis of a Therapeutic Antibody 1. Bramble MS, Pan-Filovirus Serum Neutralizing Cocktail Reveals Determinants for Cooperative and Antibodies in a Subset of Congolese Ebolavirus Broad Ebolavirus Neutralization.Immunity.2020 Feb I n f e c t i o n S u r v i v o r s . J I n f e c t D i s . 2 0 1 8 N o v 18;52(2):388-403.e12. 5;218(12):1929-1936. doi: 10.1093/infdis/jiy453 2. Long F, et al.Structural Basis of a Potent Human 2. Chukwuma VU, et al.Increased breadth of HIV-1 Monoclonal Antibody Against Zika Virus Targeting a Neutralization Achieved by Diverse Antibody Clones Quaternary Epitope.Proc Natl Acad Sci USA.2019 Jan Each with Limited Neutralization Breadth .PLoS 29;116(5):1591-1596. doi: 10.1073/pnas.1815432116.Epub One.2018 Dec 19;13(12):e0209437. doi: 10.1371/journal. 2019 Jan 14. pone.0209437. eCollection 2018. 3. Bailey JR et al.Broadly Neutralizing Antibodies with 3. Durham ND, et al .Broadly Neutralizing Human Few Somatic Mutations and Hepatitis C Virus Antibodies Against Dengue Virus Identified by Single Clearance.JCI Insight.2017 May 4;2(9). pii: 92872. doi: B cell Transcriptomics.Elife.2019 Dec 10;8. pii: e52384. 10.1172/jci.insight.92872. eCollection 2017 May 4. doi: 10.7554/eLife.52384 4. Sapparapu G, et al.Neutralizing Human Antibodies 4. Selvarajah S, Sexton NR, Kahle KM, et al.A neutralizing Prevent Zika Virus Replication and Fetal Disease in monoclonal antibody targeting the acid-sensitive M i ce . N atu re   5 4 0 ,   4 43 – 4 47 ( 2 0 1 6 ) . ht t p s : // d o i . region in chikungunya virus E2 protects from disease. org/10.1038/nature20564 PLoS Negl Trop Dis.2013;7(9):e2423.Published 2013 5. Marcandalli J, et al.Induction of Potent Neutralizing Sep 12. doi:10.1371/journal.pntd.0002423 A n t i b o d y R e s p o n s e s b y a D e s i g n e d Pr o t e i n 5. Saphire EO, Schendel SL, Fusco ML, et al.Systematic Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Analysis of Monoclonal Antibodies Against Ebola Cell.2019 Mar 7;176(6):1420-1431.e17. doi: 10.1016/j. Virus GP Defines Features that Contribute to cell.2019.01.046 Protection.Cell.2018;174(4):938-952.e13. doi:10.1016/ 6. Collinson-Pautz MR, Slawin KM, Levitt JM, Spencer j.cell.2018.07.033 DM.MyD88/CD40 Genetic Adjuvant Function in Cutaneous Atypical Antigen-Presenting Cells Contributes to DNA Vaccine Immunogenicity.PLoS One.2016 Oct 14;11(10):e0164547. doi: 10.1371/journal. pone.0164547. eCollection 201 7. Tang, N, Zhang Y, Sadigh Y , Mo K., Shen, Z, Nair, V. and Yao, Y. Generation of a Triple Insert Live Avian Herpesvirus Vectored Vaccine Using CRISPR/Cas9- Based Gene Editing.Vaccines.2020 Feb 21;8(1). pii: E97. doi: 10.3390/vaccines8010097 15
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