iQue試薬キット

iQue®試薬キット 短時間で有効な解を導くた めのハイスループットマルチ プレックスソリューション

iQue®試薬キット iQue®試薬キットは、ハイコンテント、ハイスループット、フローサイトメトリーベースの分析により、複雑な生物学の知見を 得るための統合ソリューションを提供します。iQue®試薬キットは、iQue®の先見性に富んだフローサイトメトリープラットフォー ム上での使用と iQue Forecyt®ソフトウェアによる解析を念頭に開発されています。 - iQue Qbeads®キットおよびiQue® Qpanelsキットを使用する と、個々のビーズタイプ上で特定のタンパク質を捕捉、解析 - 生物学的知見：マルチパラメーターデータにより、細胞集団の理解をさらに深めることができるため、 より詳細で有効な結果が得られます。 し、分泌サイトカイン、接着分子、酵素、成長因子受容体などの スピード：96ウェルプレートを 5分足らずで解析でき、 マルチプレックス定量が可能になります。 384ウェルプレートでもわずか 20分ほどで済むため、 - 短時間で結果を得ることができます。 iQue®試薬キットでは、細胞周期、アポトーシス、細胞膜完全 操作性：シングルプラットフォームアッセイを活用し 性、増殖、抗体の特性評価など、複数の機能的読み出し情報 たワークフローの合理化と iQue Forecyt®によるデー のほか、ビーズや細胞、あるいはその両方で様々な免疫細胞 タ解析により、複数のソースからデータを収集して 機能の測定が可能になり、フェノタイプと機能を同時に評価で - 相関関係を見いだすための時間が節約されます。 きます。 アッセイボリュームのコンパクト化：わずか 5 µLの使用 量でより多くの分析が可能なため、貴重なサンプルや試 薬を節約できます。 iQue®試薬キット 抗体の探索と開発 養子細胞療法 小分子スクリーニング プロセスを通して抗体の結合、機能お 少ない細胞数と少量の試薬で、複数の 創薬プロセスを通して、免疫生物学の よび力価のマルチプレックスデータを取 細胞パラメーターをより短時間で評価し ハイコンテントなフェノタイプスクリーニ 得することで、データのスループットと ま 品- 質が向上します。- 抗体スクリーニング - - 機能プロファイリング - す。 ン-- グを実施します。 免疫細胞による傷害 初代免疫細胞スクリーニング- 免疫細胞の評価 - 免疫機能サイトカインプロファイリング 作用機序 細胞株開発 2

キット一覧 キットタイプ 主な特長 適切な用途 ページ iQue Qbeads® ニーズに合わせた設定変更が可能 サイトカインプロファイリング、 4 Plexscreenキット2、3 メニューから最大 30個のアナライトをマル 薬剤スクリーニング、 ヒト、マウス、ラットの分泌 チプレックス分析 バイオマーカー探索 タンパク質を捕捉 事前設定済みの解析テンプレートを使用 iQue Qbeads® 独自のアナライトを、iQue Qbeads® サイトカインプロファイリング、 4 Devscreenキット3 Devscreen SHでは最大 30個まで、また フェノタイプスクリーニング、 独自の標的タンパク質の結合 iQue Qbeads® Devscreen SAvでは最大 抗体スクリーニング または抗体の捕捉による非常に 5個までマルチプレックス分析 高い柔軟性 iQue® Qpanelsヒトヘルパー 事前設定済みのプレミックス試薬による サイトカインプロファイリング、 5 Tキット1 使いやすさ ヘルパー T細胞分泌サイトカイ 単一サンプルで最大 9個のアナラ ンの解析 イトを定量化 iQue®免疫細胞・ビーズ T細胞特性評価・免疫細胞傷害性キット サイトカインプロファイリング、 6～ 11 ベースキット1 では、免疫フェノタイプ検査用マーカー、 T細胞の生物学、 単一アッセイで免疫のフェノタイ 細胞の健康状態、細胞機能、サイトカイン 免疫フェノタイプ検査、 プおよび機能を評価 プロファイリング用マーカーを単一ウェル 免疫細胞による傷害、 で測定 特性評価 最小限の操作時間でも再現性の高い、 合理化されたワークフロー 抗体の特性評価用iQue®セル・ 単一アッセイで細胞と分泌タンパク質の クローン選択、IgG力価、 12～ 14 ビーズベースキット1、2 両方を同時解析 アイソタイピング、 クローンのスクリーニング、 細胞の健康状態、 および抗体探索作業のスピード 少ないサンプルから、従来のアッセイよ 抗体インターナリゼーション アップ り短時間で情報に基づいて判断するため のデータを生成 抗体インターナリゼーションの ハイスループット評価 iQue®セルベースキット1、2、3 細胞の活性化、分化、情報交換、死など、 細胞周期、アポトーシス、 15～ 19 細胞周期、細胞の健康状態、 様々な生物学的プロセスにわたる細胞 細胞膜の活性、 アポトーシス、細胞膜完全性、 の健康状態や細胞機能に関する複数の 膜標的抗体スクリーニング、 増殖を理解 評価項目を測定 増殖状況 複数の細胞株をコード化し、 単一ウェル内でマルチプレックス 解析 1. 96ウェルフォーマットおよび 384ウェルフォーマットで使用可能 2. 洗浄手順を不要とすることで、再現性の向上とアッセイ時間の短縮を実現 3. 高い柔軟性を持ち、他のキットによるマルチプレックス化に対応 次の内容の詳細と発注については、shop.intellicyt.comを ご覧ください。 試薬とキット（用途、機器、種反応性、研究分野別で検索） 当社の試薬とキットすべての詳細情報 3

サイトカインプロファイリングおよびビーズ ベーススクリーニング iQue Qbeads®キットおよびiQue® Qpanelsキット iQue Qbeads®試薬ファミリーを使用すると、最小限 長因子受容体などの生物学的パラメーターのマルチ のサンプルボリュームとシンプルで短時間のワークフ プレックス定量が可能となります。iQue Qbeads® ローにより、個々のビーズタイプで特定のタンパク質 では、iQue Qbeads® Plexscreen試薬と iQue を捕捉して、分泌サイトカイン、接着分子、酵素、成 Qbeads® Devscreenキットの 2タイプが提供されています。 iQue Qbeads® Plexscreenキット シSinンgグleレt bッeトadビsーズ - RL2--A 50個以上のアナライトから選択し、ヒト、マウス、ラットの - 分泌タンパク質を定量化 01 11 21 26 独自のパネルを構成し、オンラインアッセイビルダーツール 06 02 16 を使用して単一ウェルで最大 30個の分泌タンパク質を 105 12 1 5 22 07 17 27 解析 03 13 23 28 08 図 1：各キットでは、付 18 29 パネルの構築と見積もりのご依頼について 04 14 属アナライト用に事前定 24 義済みの解析テンプレー は、www.intellicyt.com/qbeads-assay- 09 19 builderをご覧ください。 05 30 トが提供される。 - 104 15 1 4 25 サンプル取得前のビー 10 20 ズ集団ゲートは空だが、 解析速度を低下させることなく、他の iQue®キットと 取得中に適切なビーズ - 組み合わせ可能 が注入される。 - - 簡素化された洗浄手順（洗浄不要と洗浄 1回） 1 5 105 1 6 106 RLL1-1H キットには、検出試薬、標準タンパク質、緩衝液、 -H および事前定義済み解析テンプレート（図 1）が付属し、 サンプルから判定までのワークフローを最短化 TNF α標準物質 測定値は蛍光強度として定量的に測定、または検 6..0 量線を使用して溶液の濃度（pg/mL）に補間（図 2） 5..5 5..0 4..5 iQue Qbeads® Devscreenキット 4..0 0 11 2 3 4 iQue Qbeads® Devscreenキットを使用すると、ユー llog ((concenttrrattiion)) pg/mL ザーが独自に捕捉した抗体または標的タンパク質を、 iQue Qbeads® IFN γ標準物質 上で自由に結合させることができます。 Devscreenのビーズは、ストレプトアビジンまたはスルフ 6..0 ヒドリル官能基のいずれかでコートされた状態で提供さ 5..5 れます。 5..0 iQue Qbeads® Devscreenストレプトアビジン 4..5 コ- ート試薬 図 2：各種サイトカイン - 4..0 - スクリーニング用のストレプトアビジンコートキット（図 3） のサンプル検量線 5種類のビーズ集団で使用可能 0 11 2 3 4 llog ((concenttrrattiion)) pg/mL Plexscreenまたは Devscreenスルフヒドリル（SH）パネ ルのアナライトによりマルチプレックス化 詳細情報： www.intellicyt.com/qbeads-kits/ 4

iQue Qbeads® Devscreenスルフヒドリル Biotinylated Protein 誘- 導体試薬スルフヒドリルコート済みビーズは、簡単な Streptavidin 2段階のプロセスで遊離アミン官能基を持 -- つ任意の分子と共有結合 Polystyrene Bead 最大 30種類のビーズ集団で使用可能 iQue Qbeads® Plexscreen試薬キットおよび Devscreen SAv試薬キットによりマルチプレッ クスアッセイ（iQue Qbeads® Plexscreenによ るマルチプレックスアッセイではビーズ互換性 が条件） PE-detection Antibody iQue Qbeads®ヒト炎症パネルキット iQue Qbeads®ヒト炎症パネルキットを使用すると、血 Analyte 清またはインビトロ（in vitro）サンプルから、ヒトの 持つ 7つのサイトカインおよびケモカインを測定できま す。付属のサイトカインおよびケモカインは、自己免 疫疾患、慢性炎症、感染症などの病状に対する炎症 反応に関係しています。iQue Qbeads®ヒト炎症パネ ルキットのアナライトには、ヒトインターフェロンガンマ （IFN γ）、インターロイキン -2（IL-2）、インターロイ キン -6（IL-6）、CCL2（MCP-1）、CCL3（MIP-1 α）、 図 3：iQue Qbeads® Devscreen CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）が含まれています。 ストレプトアビジンコート試薬の原理 www.intellicyt.com/inflammation-panel-kit/ をご覧ください。 iQue® QpanelsヒトヘルパーTキット iQue® Qpanelsヒトヘルパー Tキットは、血漿、血清、また 各キットは様々なアナライトを組み合わせられるよう最適化 は細胞培養上清の単一サンプルで、最大 9個のアナライトを され、プレミックスしたビーズや標準物質で使いやすいよう特 定性分析および定量分析するための事前設定済みビーズに 別に設計されています。 より、ヒトヘルパー T細胞が分泌したサイトカインのマルチプ また、必要となるサンプル量はわずか 10 µLです。 レックス検出を行うよう設計されています。 iQue® Qpanelsヒトヘルパー Tキット アナライト Th1|2 | 4プレックス IL-4、IL-6、IFN γ、TNF α Th1|2 | 6プレックス IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN γ、TNF α Th1|2 | 9プレックス IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12（p70）、IL-13、IFN γ、TNF α、GM-CSF Th1|2|17 | 7プレックス IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN γ、TNF α 次の内容の詳細と発注については、shop.intellicyt.comを ご覧ください。 詳細情報： www.intellicyt.com/reagents-category/ 試薬とキット（用途、機器、種反応性、研究分野別で検索） qpanels-kits/ 当社の試薬とキットすべての詳細情報 5

免疫細胞機能および特性評価 iQue®免疫細胞・ビーズベースキット iQue®ヒトT細胞 O1ウnェe wルell 活性化キット CD4+ iQue®ヒト T細胞活性化キットでは、 T helper Th1 cytokine わずか 5～ 10 μ Lのサンプルで、免 IFNγ CD3+ CD69+ IFNγ 疫細胞のフェノタイプ、T細胞活性化 T cells Early Secretion Capture Activation Bead の早期マーカーと後期マーカー、細 胞の増殖またはコード化された標的細 CD8+ T cytotoxic 胞、細胞生存率、分泌サイトカイン濃 CD25+ Multifunctional Late cytokine 度（IFN γとTNF α）を測定するので、 Activation TNFα TNFα 従来のワークフローが合理化されます Capture Bead （図 4）。 Live Dead HLA-DR+ Detection on Qbeads® Even Later Activation Cell membrane integrity dye 図 4：単一ウェルで T細胞フェノタイプ、活性化マーカー、細胞増殖、細胞生存率、分泌サイトカ インを同時測定。T細胞増殖またはコード化された標的細胞の測定も可能（本図では省略）。 iQue®ヒトT細胞 1Oウnェe wルell CD4+ メモリーキット T helper Self-Renewal Potency TN TSCM TCM TTM TEM TEMRA TTE CD3+ iQue®ヒト T細胞メモリーキットでは、 CD45RA: + + - - - + + T cells CD45RO: - - + + + + - 様々な段階で T細胞メモリーのフェノ CD27: + + + + - - - CD8+ タイプと機能を測定すると同時に、そ CD62L: + + + - - - - T cytotoxic CD95: - + + + + + + の健康状態とサイトカイン分泌時の役 割に関する情報が得られます。この洗 浄 1回のアッセイでは最小限の操作時 Secretion 間で、細胞とビーズの両方を単一ウェ Live Pro-inflammatory Anti-inflammatory ルで同時に測定できます（図 5）。 Dead cytokine cytokine IFNγ IL-10 Cell membrane IFNγ IL-10 integrity dye Capture Capture Bead Bead Detection on Qbeads® 図 5：単一ウェルで T細胞フェノタイプ、T細胞メモリーのサブセット、細胞の健康状態、分泌サイトカ インを同時測定。 詳細情報： www.intellicyt.com/tcm 詳細情報： www.intellicyt.com/tca 6

iQue®ヒトT細胞 RL2-A コンパニオンキット IL-2 IL-6 iQue®ヒトT細胞コンパニオンキットは、 iQue®ヒトT細胞活性化キットおよびiQue®ヒト IL-17A IFN γ T細胞メモリーキットと組み合わせて使用しま 106 す。iQue®ヒトT細胞活性化キットとiQue®ヒト T細胞メモリーキットに付属するヒトサイトカイ IL-10 ンに加えて、最大6つのヒトサイトカインを測定 GM-CSF できます。 TNF α iQue®ヒトT細胞コンパニオンキットには、 独自の事前書式設定済み解析テンプレー IL-13 トが付属しています（図6）。 105 106 107 RL1-H 図 6：iQue®ヒト T細胞コンパニオンキットのサイトカイン テンプレート iQue®ヒトT細胞 1 疲弊キット Oウnェe wルell CD4+ T helper PD-1+ Lag-3+ Tim-3+ exhausted exhausted exhausted iQue®ヒト T細胞疲弊キットは、T細胞の CD3+ 疲弊、フェノタイプ解析用ヘルパー T cells T細胞 および細胞傷害性 T細胞のマーカーをマル CD8+ チプレックス化し、細胞の健康状態、およ T cytotoxic びビーズベースの分泌サイトカイン測定を 同一アッセイ内ですべて評価する際の操作 Secretion 性を考慮して設計されています（図 7）。 Pro-inflammatory Multifunctional Dead cytokine cytokine IFNγ TNFα Cell membrane IFNγ TNFα integrity dye Capture Capture Bead Bead Detection on Qbeads® 図 7：単一ウェルで細胞生存率、T細胞フェノタイプ、T細胞疲弊マーカー、分泌サイ トカイン、細胞のコード化と増殖（オプション）を同時測定。T細胞増殖またはコード 化された標的細胞の測定も可能（本図では省略）。 詳細情報： www.intellicyt.com/tce 7

iQue®マウスT細胞キット 1ウェル One well CD4+ T helper iQue®マウス T細胞キットでは、T細胞の Activated Exhausted Memory 活性化、メモリー、疲弊を測定すると同時 CD3+ T cells Tn Tcm Tcm に、その健康状態とサイトカイン分泌時の 役割に関する情報が得られます（図 8）。 CD8+ CD69+ PD-1+ T cytotoxic CD62L+ CD62L+ CD62L- CD44- CD44+ CD44+ CD44+ Pro-inflammatory cytokine IFNγ IFNγ Captur e Pro-inflammatory Live Secretion Bead cytokine IL-2 Dead iQue®ヒトT細胞フェノタイプ Cell membrane IL-2 integrity dye Capture Bead 解析キット（CD3、CD4、CD8） Detection on Qbeads® iQue®ヒト T細胞フェノタイプ解析 図 8：単一ウェルで細胞生存率、活性化と疲弊の T細胞フェノタイプマーカー、分泌サイト カイン、細胞のコード化と増殖（オプション）を同時測定。T細胞増殖またはコード化され キット（CD3、CD4、CD8）は、ヒト T細胞 た標的細胞の測定も可能（本図では省略）。 のサブセットを確実に同定できるように設計さ れています（図 9）。このアッセイは、ハイス ループットサンプリング、フローサイトメトリー 詳細情報： 検出、マルチプレックス化の機能を兼ね備え www.intellicyt.com/mouse-t-cell-kit た、iQue® 3の VBR構成および VYB構成で 実施するために最適化されています。本キッ トは非特異的な背景染色を最小限に抑える構 成で、ワークフローが最適化されているため、 サイトカインを追加することで柔軟性が向上 し、亜集団の特性をさらに評価できるように 詳細情報： なります。 www.intellicyt.com/t-cell-phenotyping A. B. C. D. すべてのイベント 生細胞 シングレット CD3+ SSC-H（106） FSC-A（106） SSC-H CD8（VL3-H） ウェルタイプ：活性 PBMC 生細胞 シングレット CD3+ 107 107 1.4 1.4 1.2 1.2 106 106 CD8+ 1.0 1.0 105 0.8 0.8 105 0.6 0.6 CD3+ 104 シングレット 0.4 0.4 104 -103 0.2 CD4+ 生細胞 0.2 0.0 0.0 103 -104 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 -105 -104-103104 105 106 107 -105 -104 104 105 106 107 FSC-H（106） FSC-H（106） CD3（VL6-H） CD4（VL4-H） 図 9：CD3または CD28抗体で 3日間活性化したヒトPBMCのフェノタイプ解析。（A）全イベントで生細胞にゲートを設定し、デブリや死細胞を除外。 （B）生細胞からダブレットを除去して単一細胞を取得。（C）シングレットの CD3+細胞。（ D）CD3+細胞の CD4+およびCD8+サブセット。 8

免疫細胞傷害性キット iQue®ヒト一般免疫 One well 1ウェル 細胞傷害性キット Pro-apoptotic protease Target Effector Granzyme B iQue®ヒト一般免疫細胞傷害性 cells cells Secretion キットは、標的細胞とエフェクター Granzyme B Capture 細胞の相違、エフェクター細胞から Bead 分泌されたアポトーシス促進性セリ Detection on Qbeads® ンプロテアーゼのグランザイム B、 Dead and dying cells ミトコンドリア膜脱分極、細胞膜完 Mitochondrial Membrane Potential Dye Cell Membrane Integrity Dye 全性、細胞数、細胞の健康状態（エ Live cells Loss of MOMP Cell Membrane Loss of Membrane フェクターおよび標的）を同時測定 Permeabilization Integrity するセル・ビーズ混合アッセイです。 図 10：免疫細胞による細胞の傷害について、ミトコンドリア膜脱分極、細胞膜完全性の喪失、細胞数、 アポトーシス促進性プロテアーゼなど、複数のメカニズムを同時解析。ミトコンドリア外膜ポテンシャル はMOMPの別名でも知られる。標的細胞とエフェクター細胞は蛍光コード色素による染色で区別（本 図ではコード色素を省略）。 詳細情報： www.intellicyt.com/ick iQue®ヒトT細胞傷害性キット O1ウnェe wルell CD25+ PD-1+ iQue®ヒト T細胞傷害性キットは、 CD8+ activated exhausted 同一アッセイ内で標的細胞の同定、細胞 Target T cytotoxic cells CD3+ の健康状態、細胞のフェノタイプと機能 T cells のマーカー、および分泌タンパク質のビー ズベースプロファイル測定をマルチプレッ CD8- T helper クス化する際の操作性を考慮して設計さ Secretion れました（図 11）。 Live Dead Pro-inflammatory Pro-apoptotic cytokine protease Cell membrane IFNγ Granzyme B integrity dye IFNγ Granzyme B Capture Capture Bead Bead Detection on Qbeads® 図 11：1つのウェルで標的細胞の同定、細胞の健康状態、細胞機能、免疫フェノタイプ検 査、サイトカインプロファイリングすべてを同時測定。標的細胞とエフェクター細胞は蛍光 コード色素による染色で区別（本図ではコード色素を省略）。 詳細情報： www.intellicyt.com/t-cell-killing 9

iQue®ヒトNK細胞 1Oウnェe wルell 傷害性キット Activated NK cells CD69+ and/or CD25+ Target CD3-CD56+ iQue®ヒトNK細胞傷害性キットは、細胞のフェ cells CD16+/- ノタイプマーカー、NK細胞の機能マーカー、 NK cells 標的細胞の同定、エフェクター細胞から分泌さ れた炎症性サイトカインとアポトーシス促進性 プロテアーゼ、さらには細胞数と細胞膜完全性 Secretion を同時測定するセル・ビーズ混合アッセイです Live Dead Pro-inflammatory Pro-apoptotic （図 12）。 cytokine protease Cell membrane IFNγ Granzyme B integrity dye IFNγ Granzyme B Capture Capture Bead Bead Detection on Qbeads® 図 12：1つのウェルで標的細胞の同定、細胞の健康状態、細胞機能、免疫フェノタイプ検査、 サイトカインプロファイリングすべてを同時測定。標的細胞とエフェクター細胞は蛍光コー ド色素による染色で区別（本図ではコード色素を省略）。 iQue®ヒトNK細胞 シングレットQbeads コンパニオンキット RL2-A iQue®ヒトNK細胞コンパニオンキットは、 iQue®ヒトNK細胞傷害性キットと組み合 CCL3（MIP-1 α） IFN γ わせて使用できます。iQue®ヒトNK細胞 傷害性キットに付属の IFN γおよびグランザ 106 イム Bに加えて、最大 6つのヒトサイトカイ ンまたはエフェクタータンパク質を測定でき CD178（Fasリガンド） ます（図 13）。 GM-CSF TNF α グランザイム A グランザイム B 105 CCL5（RANTES） 106 107 RL1-H 図 13：iQue®ヒトNK細胞コンパニオンキットのサイトカインテンプレート 詳細情報： www.intellicyt.com/nk-killing 10

主な用途：T細胞の特性評価 T細胞の生物学を理解し、より優れた治療法を構築するに と分化経路を標的とする免疫療法が多く開発されるように は、T細胞のフェノタイプと機能を徹底的に評価すること なっています。T細胞の発生過程で詳細な特性評価を行う が不可欠です。例えば、二重特異性抗体、チェックポイン ことで、より多くの知見が得られ、それが治療法の改善に ト阻害剤、CAR-T細胞など、T細胞活性化の様々な段階 つながる可能性があります。 CD3またはCD28 Dynabeads CD3 x CD19 BiTE SEB CD3 | CD28 Dynabeads CD3 x CD19 BiTE SEB Expression Expression Expression 100 % 100 % 100 % CD69 CD69 CD69 80 CD25 80 CD25 80 CD25 HLA-DR HLA-DR HLA-DR 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 Control 7.5K 15K 30K 60K 120K 240k 480k Control 0.014 0.04 0.12 0.37 1.1 3.3 10 Control 0.14 0.41 1.2 3.7 11.1 33.3 100 Target viability Target viability Target viability 100 % 100 % 100 % 80 80 80 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 Control 7.5K 15K 30K 60K 120K 240k 480k Control 0.014 0.04 0.12 0.37 1.1 3.3 10 Control 0.14 0.41 1.2 3.7 11.1 33.3 100 Expression Expression Expression 100 % 100 % 100 % PD-1 PD-1 PD-1 80 LAG-3 80 LAG-3 80 LAG-3 TIM-3 TIM-3 TIM-3 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 Control 7.5K 15K 30K 60K 120K 240k 480k Control 0.014 0.04 0.12 0.37 1.1 3.3 10 Control 0.14 0.41 1.2 3.7 11.1 33.3 100 CD3 | CD28 Dynabead density [BiTE] ng/mL [SEB] ng/mL メモリー CCDCD3D3 |3 C| C|D CD2D2828 D8 Dy Dnynyanbabaebeaedadasdss CCDCD3D3x3CxCxDCD1D919 1B9 Bi TBiTEiTEE SSESEBEBB %% o% fo Cfo CfD CD3D+3 +3c e+c leclslel sall tsa tat ILI-L1I-L01-010 %% o% fo Cfo CfD CD3D+3 +3c e+c leclslel sall tsa tat ILI-L1I-L01-010 %% o% fo Cfo CfD CD3D+3 +3c e+c leclslel sall tsa tat ILI-L1I-L01-010 dedvedvelevolepolmpompemnetne stn tsta tsgategaege (n(gn(/gnm/gm/Lm)L)L) dedvedvelevolepolmpompemnetne stn tsta tsgategaege (n(gn(/gnm/gm/Lm)L)L) dedvedvelevolepolmpompemnetne stn tsta tsgategaege (n(gn(/gnm/gm/Lm)L)L) 303030 2.20.20.0 303030 2.20.20.0 303030 2.20.20.0 NNoNno-noa-nca-tcaivtciavtitavetadetded NNoNno-noa-nca-tcaivtciavtitavetadetded NNoNno-noa-nca-tcaivtciavtitavetadetded 30303 K0 K K 1.51.51.5 00.102.1 2.n1 2gn /gnm/gm/LmLL 1.51.51.5 1.21. 21n. 2gn /gnm/gm/LmLL 1.51.51.5 202020 12102102 K0 K K 202020 1.11.1 n1.1 gn1 /gnm/gm/LmLL 202020 111.11 .n1 .gn1 /gnm/gm/LmLL 48408408 K0 K K 1.01.01.0 1010 1n0 gn /gnm/gm/LmLL 1.01.01.0 101010 n0 gn /gnm/gm/LmLL 1.01.01.0 101010 101010 101010 00.50.5.5 00.50.5.5 00.50.5.5 000 00.00.0.0 000 00.00.0.0 000 00.00.0.0 TnTnTnTsTcsTmcsmcmTcTmcTmcmTtTmtTmtmTeTmeTmemTtTetTeteILI-LI1-L01-010 TnTnTnTsTcsTmcsmcmTcTmcTmcmTtTmtTmtmTeTmeTmemTtTetTeteILI-LI1-L01-010 TnTnTnTsTcsTmcsmcmTcTmcTmcmTtTmtTmtmTeTmeTmemTtTetTeteILI-LI1-L01-010 MMeMmemeomroyro ypr yhp ehpnehonetonytopytepyepe MMeMmemeomroyro ypr yhp ehpnehonetonytopytepyepe MMeMmemeomroyro ypr yhp ehpnehonetonytopytepyepe 図 14：アドバンストフローサイトメトリー iQue® 3プラットフォームは、T細胞のマルチプレックス研究用に安定したハイスループットソリューションを提供。 当社の 4つの T細胞特性評価キット（iQue®ヒト T細胞活性化キット、iQue®ヒト T細胞傷害性キット、iQue®ヒト T細胞疲弊キット、iQue®ヒト T細胞 メモリーキット）と組み合わせることで、従来の非常に面倒な方法なしに、細胞フェノタイプ、T細胞マーカー、細胞増殖、細胞生存率、分泌サイトカイ ンを単一サンプルで測定し、評価するための簡便な方法を提供。 11 疲弊 キリング 活性化

抗体の特性評価 iQue®セル・ビーズベースキット iQue®ヒト A. B. ヒト IgG検量線 Cy-Clone™プラス 8b. Human IgG standard curve O1ウnェe wルell iQue®ヒトCy-Clone ™プラスを使 用すると、洗浄不要の簡単なミック FL- スアンドリードアッセイで数千のク competing IgG 6.0 IgG ローンを速やかに解析できます。こ in sample れは、情報に基づいて細胞産生能 Cell membrane integrity dye を判定するために、単一ウェルで 5.0 IgG定量、細胞生存率、細胞数を 相互に関連付ける唯一のソリュー IgG Capture ションです。 Bead 4.0 Viable Dead -1 0 1 2 3 4 log (concentration) μg/mL 図 15：（A）iQue®ヒトCy-Clone ™プラスの原理。分泌 IgGおよびCHO生産細胞を含むサンプルに 蛍光標識された lgG（FITC-lgG）を添加。FITC-lgGおよび非標識サンプルの lgGが競合的に IgGキャ プチャービーズと結合。膜不透過型の完全性色素を用いて、各ウェルで細胞生存率を同時測定。（B） IgG濃度は蛍光シグナルの強度に反比例。 IgG濃度（µg/mL） 細胞あたりの IgG濃度 プロファイルマップ 1 細胞生存率 細胞数 384ウェルのうち、11ヒットが全基準に適合（ヒット率 2.865%） 図 16：単一ウェルで IgG濃度、細胞数、細胞生存率を関連付け。iQue Forecyt®のプロファイルマップ機能はカスタマイズ可能。これに より、ユーザーは目的の全選択基準に満足するヒットを容易に特定可能。 詳細情報： www.intellicyt.com/cy-clone-plus 12

iQue®マウスIgG型・ 力価アッセイ このアッセイは簡単かつ洗浄不要で、 B. RBep.. 代Rrees表pern的etsaなetniv検tea 量tSivt線aen S（dtaマrndウd Caスrudr IvCgeGusr 1(v、Mes2o (auM、seo2 ulgbsG、e 1l3g, 2）Ga1, ,2 2ba,, a2nbd, a3n)d 3) スクリーニングプレートの各ウェルか mlgGm1 lsgtGan1d satardndard mlgGm2lag sGta2nad satardndard ら 2時間足らずでマウスごとの IgG log (mloegd (imane BdiLa1n- HB Lo1f- mH logfG m1)lgG1) log (mloegd (imane BdiLa1n- HB Lo1f- mH logfG m2lag)G2a) アイソタイプ、細胞数、生存率を簡 5.2 5.2 5.2 5.2 単に同時定量測定でき、抗体の探索 5.0 5.0 5.0 5.0 が促進されます。 4.8 4.8 4.8 4.8 4.6 4.6 4.6 4.6 4.4 4.4 4.4 4.4 4.2 4.2 4.2 4.2 4.0 4.0 4.0 4.0 3.8 3.8 3.8 3.8 3.6 3.6 3.6 3.6 3.4 3.4 3.4 3.4 -1 -1 0 0 1 1 -1 -1 0 0 1 1 A. log (clogn c(ceonntrcaetniotnra) tμiogn/m) μLg/mL log (clogn c(ceonntrcaetniotnra) tμiogn/m) μLg/mL Mouse hybridoma FL- IgG1 in or B cells competing mlgGm2lbg Gst2abnd satardndard mlgGm3l gstGan3d satardndard sample IgG1 log (mloegd (imane BdiLa1n- HB Lo1f- mH logfG m2lbg)G2b) log (mloegd (imane BdiLa1n- HB Lo1f- mH logfG m3l)gG3) 5.2 5.2 5.2 5.2 5.0 5.0 4.8 4.8 5.0 5.0 IgG1 Viable 4.6 4.6 4.8 4.8 Dead 4.4 4.4 FL- FL- FL- 4.6 4.6 4.2 4.2 competing competing competing 4.0 4.0 4.4 4.4 IgG2a IgG2a IgG2b IgG2b IgG3 IgG3 in sample in sample in sample 3.8 3.8 4.2 4.2 3.6 3.6 3.4 3.4 4.0 4.0 3.2 3.2 3.8 3.8 IgG2a IgG2b IgG3 3.0 3.0 -1 -1 0 0 1 1 -1 -1 0 0 1 1 log (clogn c(ceonntrcaetniotnra) tμiogn/m) μLg/mL log (clogn c(ceonntrcaetniotnra) tμiogn/m) μLg/mL 図 17：（A）iQue®マウス IgG型・力価キットアッセイの原理。この競合アッセイは洗浄不要で、4つのアイソタイプ特異的 IgGキャプチャービーズに対し、 細胞分泌 IgGとマウスFITC-IgGが異なる結合をすることで働く。IgG濃度は蛍光シグナルの強度に反比例。細胞膜不透過型の完全性色素を用いて、各ウェ ルで細胞生存率を同時測定。（ B）各ウェルの 4つのアイソタイプ特異的ビーズ全体の IgG濃度は、iQue Forecyt®でアイソタイプごとの検量線から自動計算。 IgG量 プロファイルマップ - マウス IgG1 図 18：iQue Forecyt®を使用すると、ヒートマップを簡単に作成して個々のアイソタイプ分泌傾向を可視化、またはカスタマ イズ可能なプロファイルマップにより目的の分泌プロファイルを持つウェルを容易に特定可能。 詳細情報： www.intellicyt.com/mouse-igg-kit 13

iQue®ヒトおよびマウスの iQue®ヒトおよびマウスの 抗体インターナリゼーション試薬 抗体インターナリゼーションキット 多くの抗体セットを素早くプロファイリングして比較し、抗体 iQue®ヒトおよびマウスの抗体インターナリゼーションキッ インターナリゼーションなど、それらの主要な属性の特性評 トは、30 µLの単一アッセイボリュームから抗体インター 価を行うことができるため、候補の生成に要する時間が大 ナリゼーション、抗体特異性、細胞の健康状態を測定す 幅に短縮されるとともに、有望な治療法の開発が促進され る、洗浄不要のハイスループットマルチプレックスアッセイ ます。iQue®ヒトおよびマウスの抗体インターナリゼーショ です。抗体は、pH感応型の iQue®抗体インターナリゼー ン試薬は、簡単なプレートベースフォーマットで 20 μ Lのサ ション試薬（R/Red）で容易に標識されます。細胞生存 ンプルから抗体インターナリゼーションを識別する、洗浄不 率についても、iQue®細胞膜完全性色素（B/Green）を 要の pH感応色素です。マウス型とヒト型があり、マウスま 使用して同一アッセイ内で測定し、一般的な細胞の健康 たはヒトの Fc領域を含む抗体での使用を目的としています。 状態と抗体機能を評価します。同じサンプルで、付属の このアッセイには、ハイスループット機能を持つ、洗浄不要 iQue®細胞増殖・コード化色素 V/Blue（Tag-it Violet ™） のマルチプレックス手順向けの他の有効試薬と自由に組み を使用すれば、細胞特異性の特性評価が可能です。 合わせられるという特徴があります。 ABI White Paper Graphics figure 2 — 20200330 from Adrian Kimpton, with supervision by Matt Samuels Antibody Internalization Reagent Principles Outside cell: Inside cell: pH ~7.4 pH ~7.0–7.2 Antibody Mix Antibody Add labeled test antibody Early Late Lysosome: Internalization Internalization to cells and read on iQue® 3 endosome: endosome: pH ~4.7 Reagent Reagent with (iQue® 3 VBR, BR, BR HD) pH ~6.3 pH ~5.5 test antibody 図 19：iQue®ヒトおよびマウスの抗体インターナリゼーション試薬とキットのアッセイ原理。抗体インターナリゼーション試薬で標識された抗体は、中性 pH ではほぼ蛍光を発しないが、内在化され酸性のリソソームまたはエンドソーム経路で処理されると低 pHで強い蛍光を発光。 A. 単一細胞 B. 内在化率 単一細胞に占める内在化抗体の割合（%） イベント数 100.0 CD71 500 内在化された 抗体 mlgG 80.0 400 25.05% 図 20：（A）各種集団（細胞、単一細胞、 60.0 内在化された抗体）に事前設定済みの 300 テンプレートゲートを提供。また、この 200 40.0 テンプレートでは、MFIおよび対照サ ンプルの内在化率に対してプロットした 100 20.0 用量反応曲線も提供。（B）単一細胞 に占める内在化抗体含有細胞の数な 0 0 ど、追加サンプルの検量線も生成。 102 103 104 105 106 107 -3 -2 -1 0 RL1-H log（濃度）μ g/mL 詳細情報： www.intellicyt.com/multicyt-kits 14

一般的な細胞の健康状態および解析 iQue®セルベースキット iQue®セルベースキットでは、生存率、増殖、アポトー 洗浄不要のミックスアンドリード手順により最適化され シスなど、細胞の健康状態および細胞機能に関する複 ており、他の iQue®セルベースキットまたはビーズベー 数の評価項目を解析できます。これらのキットの多くは スキットを使用してマルチプレックス化できます。 アポトーシス BL2 Phosphatidylserine iQue®ヒト4プレックス surface expression アポトーシスキット BL4 RL1 Plasma membrane Mitochondrial integrity 洗浄不要の iQue®ヒト 4プレックスア BL1 membrane potential ポトーシスキットを使用すると、毒性 Caspase 3/7 H+ H+ H+ の強すぎる治療を識別する総細胞数 activation に加え、単一サンプルからカスパーゼ 3/7の活性化、アネキシンVの結合、 細胞生存率、ミトコンドリア脱分極を 同時検出できます（図 21）。4つの試 図 21：iQue®ヒト 4プレックスアポトーシスキットの原理。（ BL1）：活性化酵素による開裂後にカスパー 薬すべてを同時に入れることも（図 22 ゼ 3/7の活性化を検出。（ BL2）：アネキシンVの結合によりホスファチジルセリンの表面発現を検出。 （A）および 22（B））、実験の目的に沿っ （BL4）：損傷した（有孔）膜を通じた膜不透過型色素の取り込みにより細胞生存率を測定。 て各試薬を個別に組み合わせて使用す （RL1）：ミトコンドリアが健康で膜電位を維持できる場合に、ミトコンドリア内腔に局在する色素により ミトコンドリア膜電位を測定。ミトコンドリアの脱分極時に色素が細胞質内に漏出し、その蛍光能力を ることもできます。 喪失。 A. 500 500 500 500 400 アAネnnキeシxinン VV 400 N生on育-v不ia能ble 400 カCスasパpaーseゼ 33/7/7 400 ミトコMンitドoリア Da損m傷age 300 300 300 300 200 200 200 200 100 100 100 100 0 0 0 0 102 103 104 105 103 104 105 103 104 105 103 104 105 B. Annexin V non-T cells Non-viable non-T cells Caspase 3/7 non-T cells Mito Depolarized non-T cells as % of non-T cells as % of non-T cells as % of non-T cells as % of non-T cells 100.0 100.0 100.0 100.0 80.0 80.0 80.0 80.0 60.0 60.0 60.0 60.0 40.0 40.0 40.0 40.0 20.0 20.0 20.0 20.0 0.0 0.0 0.0 0.0 -1 0 1 2 3 4 -1 0 1 2 3 4 -1 0 1 2 3 4 -1 0 1 2 3 4 log (concentration) nM log (concentration) nM log (concentration) nM log (concentration) nM Staurosporine Mitomycin C Methotrexate Dexamethasone 図 22：（A）細胞死の 4つの異なる特徴から、アポトーシス経路の特定が可能。（B）スタウロスポリン、マイトマイシンC、メトトレキサート、デキサメタ ゾンの添加に対する化合物用量反応曲線。ヒストグラムおよび用量反応曲線は iQue Forecyt®で生成。 15

細胞周期 iQue®細胞周期キット iQue®細胞周期キットでは、DNA挿入型蛍光色素を使用し、 G0期または G1期、G2期またはM期、S期の識別に十分 な感度で含量を記録します（図 23）。 従来法とは異なり、このキットでは洗浄段階が不要で、透過 処理、修復処理、またはリボヌクレアーゼ処理を実施せずに G0 G1 G2 M 生細胞を染色でき、1時間の培養が 1回で済みます。 S 図 23：DNA含量による細胞周期の特定 イベント数 Untreated Nocodazole Complete Cell Cycle % of cells in G0 | G1 relative to total cells 700 G0 | G1 600 S % of cells in S relative to total cells 500 % of cells 400 G2 | M in G2 | M relative to total cells 300 200 100 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 DNA Content (BL4-A) (106) Control-based gates are objectively applied to every well. 図 24：iQue®細胞周期キットを使用して、細胞周期阻害剤ノコダゾール（灰色のヒストグラム）の効果を未処理の細胞（黄色のヒストグラム）と 比較可能。iQue Forecyt®ソフトウェアのヒートマップ機能を使用して、各サイクル（G0または G1、G2またはM、S）における細胞の割合を複 数のプレート間で短時間のうちに比較可能。 16

細胞生存率 iQue®細胞膜完全性色素 iQue®細胞膜完全性色素は膜不透過 型の独自試薬で構成されており、細 胞の健康状態の測定値として試薬の Cell membrane integrity dye 排出と細胞膜の完全性を利用して細 胞生存率を判定できます（図 25）。 iQue®細胞膜完全性色素は、他の iQue®試薬で柔軟にマルチプレック ス化できる、4つの異なる励起域と 発光域で使用できます。試薬投入 後、最大 48時間まで最小限の細胞 毒性を保ち、洗浄不要のアッセイワー クフローと最適化された滴定による 高い信号安定性をユーザーに提供 Intact membrane Compromised membrane します。また、B | Red試薬色素は、 4%パラホルムアルデヒド（PFA）の 図 25：iQue®細胞膜完全性色素アッセイの原理。膜に傷のない細胞 は膜不透過型試薬を排除でき、非蛍光性を維持。膜が損傷すると細胞 固定化後も最大 18時間まで蛍光性 に試薬が入り、インターカレーションによりDNAと結合して検出可能な を有し、HeLaや A459などの接着細 蛍光シグナルを発生。 胞にも対応します。 B | Green細胞膜完全性試薬の B | Red細胞膜完全性試薬の 代表デ38ーr23タ.8prd2f. p d f1 19 / 1 69//2106 / 2 08 : 5 38 :P5M3 PM代表データ BL1 BDLy1e D-syineg-sleintglet SingSleintg cleltl scells WelWl Tyepll eT:y Npe:g Nateivgeative NegNateivgea tCivoen Ctronl trol WelWl Tyepll eT:y Ppoes: iPtiovseitive PosiPtiovsei tCivoen Ctronl trol # ev#e netvsents # ev#e netvsents 100 100 600600 90 90 IntacItntactComCporommpisroemd ised IntacItntactComCporommpisroemd ised 80 80 memmbreamnebranmeemmbreamnebrane 500500 memmbreamnebranmeemmbreamnebrane 70 70 400400 60 60 50 50 300300 40 40 30 30 200200 20 20 100 100 10 10 0 0 0 0 100 110001 110012 110023 110034 110045 110056 110067 107 100 110001 110012 110023 110034 110045 110056 110067 107 BL1-BHL1-H BL4B-HL4-H 図 26：無傷の膜と損傷した膜を有する細胞集団を識別する測定値の例 詳細情報： www.intellicyt.com/multicyt-kits 17

細胞増殖 iQue®細胞増殖・コード化色素 iQue®細胞増殖・コード化色素は、それぞれ第一級アミン 一蛍光チャネルの様々な強度で 2～ 4種類の細胞集団を標 基またはグルタチオンに結合して蛍光を発する、スペクトル 識（コード化）する際に、柔軟性の高い安定したソリューショ 的に異なる独自の細胞透過性色素で構成されています。長 ンを提供します。各色素は複数の標準サイズで単体販売され 時間の研究に適した最小限の細胞毒性と高い安定性により、 ており、要洗浄 / 洗浄不要、標準手順の有無で選択できます。 最大 6世代まで細胞増殖を観察できるうえ、細胞の第 1世 どちらも 3つの異なる励起域または発光域に対応し、細胞 代と第 2世代間で蛍光強度に差がありません。また、iQue® 増殖またはコード化のいずれかに使用できます。また、他の 細胞増殖・コード化色素をコード化に使用した場合は、単 iQue®試薬でマルチプレックス化できます。 死細胞 潜伏細胞 増殖性細胞 世代 0 世代 1 世代 2 図 27：iQue®細胞増殖色素のアッセイ原理。増殖性細胞の色素量は減少、それに応じて蛍光強度も低下。 死細胞と潜伏細胞では最初の色素強度が維持されるため、増殖細胞と非増殖細胞の区別が容易。 A. RL1-Hヒストグラム B. RL1-H 1Dヒストグラム C. RL1-HとFSC-Hの 2Dプロット シングレット細胞 シングレット細胞エンコーダー # events # events Stain: mixture FSC-H 1:6 Serially titrated 80 100 Proliferated 70 90 Bright 107 Mid Pop Pop Pop Pop 60 Non- 80 1 2 3 4 proliferated 70 Dim 50 control 60 40 Unstained 50 Unstained 30 control 106 40 20 30 20 10 10 0 0 105 101 102 103 104 105 106 107 101 102 103 104 105 106 107 101 102 103 104 105 106 107 RL1-H RL1-H RL1-H 図 28：（A）増殖した細胞集団の特定。（B）と（C）では様々なコード化された細胞集団を特定。iQue®細胞増殖・コード化色素では、浮遊（PBMC（上 記）、Jurkat、Ramos、U937）と接着（HeLa、A549、H4）の両方の細胞株を使用して、スクリーニング向けに広範なテストが行われています。 18

主な用途：免疫細胞による傷害 新生腫瘍細胞など、不要な標的細胞の免疫細胞認識および One Well 傷害は、ヒト宿主防御機構の重要な要素です。iQue®キット Effector Non-viable and Viable には、免疫細胞傷害性に関する応用分野向けに、iQue®プラッ Caspase + Target Target トフォームで検証された最適化試薬が含まれています。 -- 養子 T細胞免疫療法 - キメラ抗原受容体-- 腫瘍浸潤リンパ球 NK細胞 可溶性 T細胞誘導 他の iQue®キットで自由にマルチプレックス化して解析を 深化させ、含有量を高めることで、免疫細胞による傷害 のメカニズムについて、さらなる知見を獲得することがで きます。iQue®細胞膜完全性色素で標的細胞とエフェク 図 29：iQue®コード化色素を使用して標的細胞とエフェクター ター細胞の両方で生存率を観察し、iQue®コード化色素 細胞を識別。死細胞は iQue®細胞膜完全性色素で標識。さら で細胞を識別し、免疫細胞による傷害に対するアポトー に試薬を追加し、アポトーシスと増殖を評価してサイトカインプ ロファイリングとフェノタイプ解析を実施。 シスを検出します（図 29および図 30）。 Single cells Effector SSC-A NK92 NK92 # events # events 107 1200 1200 Effector 1000 1000 NK92 non-viable 800 NK92 800 8.97% 600 Caspase 3+ 7.45% 600 106 400 400 200 200 0 0 101 102 103 104 105 106 107 102 103 104 105 BL1-H BL4-H 105 Target Target Jurkat Jurkat # events # events 140 100 102 103 104 105 106 120 Jurkat Jurkat Caspase 3+ 80 non-viable RL1-A 100 37.64% 33.62% 80 60 60 40 40 20 20 0 0 102 103 104 105 106 101 102 103 104 105 BL1-H BL4-H 図 30：免疫細胞による傷害に対する標的細胞のアポトーシスと生存率を観察。iQue®コード化色素、iQue®カスパーゼ 3/7キッ ト、iQue®細胞膜完全性色素を使用して、単一アッセイで標的細胞とエフェクター細胞すべての死を個別に観察。 19

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