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薄層クロマトグラフィー（はくそうクロマトグラフィー、英: thin-layer chromatography、略称: TLC）はガラスの板の上にシリカゲル、アルミナ、ポリアミド樹脂などを薄く張ったもので、主に、反応の進行状況を迅速に確認したり、カラムをする際の分離条件を検討したり分離を確認したりして、物質の定性を行う際に用いられる。担体のシリカゲルはカラムクロマトグラフィーと同じであるが、粒子の細かいものが使われているので分離能が高い。通常は順相のシリカゲル担体を用いるが、逆相シリカゲル担体や化学修飾担体（アミンや光学活性体で修飾した担体）のTLCも販売されている。スポットの移動距離を溶媒の移動距離で割ったものをRf値（retention factor value、Rf value）と呼ぶ。Rf値は溶離液組成、温度、担体、チャンバーの溶媒蒸気の飽和度、スポット量を管理すれば再現性があるので、サンプル同定にも使用できる。カラムクロマトグラフィーとTLCとは両者ともRf値の順番で化合物が流出することがほとんどであるが、まれにカラムとTLCとで溶離順が一致しないことがあるので注意が必要である（大抵は、Rf値が0.5以上の条件で溶離したり、無理に流速を上げたり、またはサンプルをオーバーロードしたりといった、クロマトグラフィーの原理を無視することで発生する）。また、シリカゲルが厚く（1-2 mm厚）張られたものを用いて少量（100 mg程度まで）の混合物の分離に用いられることもあり、分取TLC（preparative TLC、PTLC）と呼ばれる。
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