メチル化解析、変異およびSNPの定量解析のソリユーション　PyroMark Q48 Autoprep

Product Profile PyroMark™ Q48 Autoprep パイロシークエンスが導くメチル化解析、変異および SNPの定量解析のソリューション PyroMark Q48 Autoprepは、サンプルの前処理からパイロシークエンスまで自動化しました。新設計のソフトウェアにより、 従来のモデル PyroMark Q24 Advancedの 2倍の処理能力を実現しました。もちろん解析性能はそのままです。 目的の遺伝子の機能解析の充実だけでなく、NGSやマイクロアレイ解析からの検定や精査を担える理想的な一台となっています。 PyroMark Q48 Autoprepの特長： • マニュアル操作を極力排除 ̶ サンプルの前処理から解析までの自動化プロトコール • 簡単操作 ̶ 装置やソフトウェアは直感的操作性を重視し、操作性も抜群 • 高い処理能力 ̶ 1ラン 48サンプルの処理能が研究を加速 • パイロシークエンスのベストパフォーマンスモデル ̶ 信頼のロングリード技術 * • D NAメチル化解析の解釈 ̶ CpG、CpNサイトでの定量性が遺伝子制御の理解をアシスト • より多くの SNPや変異情報を提供 ̶ マルチプライマーディスペンセ―ション機能が処理能力を加速 * 最大の平均リード長 60～ 100塩基 サンプルの前処理を自動化することにより、マニュアル操作を最小化 PyroMark Q48 Autoprepは、直感的ソフトウェアと見やす ことができます。さらにMulti Primer Dispension（MPD）機能 いタッチスクリーンを搭載した卓上型のコンパクトモデル を使うことで、運転あたりのアッセイ数を増やすことができ です。プロトコールの全てのステップは、画面に表示され、 ます。 パイロシークエンスのプロトコールの入力は、対話をするよ うに行なえるので、操作もとても簡単です。全てのプロトコー ルは、サンプル、磁気ビーズおよび試薬をロードすれば、全 自動で処理が進む設計になっています。PCR産物からの一本 鎖 DNAの精製やシークエンスプライマーのアニーリングと いったシークエンスの前処理は装置が行なうため、ユーザー がすることは何もありません（図 2）。 オプションとして、シークエンスプライマー添加をマニュア ルで行なうことで、1回の運転あたりアッセイの数を増やす 図 1. PyroMark Q48 Autoprep Sample to Insight

Load Load PCR Insert Load run Automatic Anneal reagents, product & absorber les via USB template sequencing nucleotides, magnetic Pyrosequencingstrip & disc or network preparation primers buffers beads 図 2. サンプルの前処理からパイロシーケンスまでを自動化した PyroMark Q48 Autoprepのワークフロー 4つのリザーバーを持つ 3つのカートリッジから試薬、ヌクレオチド、シークエンスプライマーおよびバッファーを供試することで、サンプルの前処理からパイロ シークエンスまでを自動で処理できる。カートリッジに試薬をセットし、サンプルと磁気ビーズをディスクに分注した後、ディスクとアブソーバーストリップを 装置にセットする。ランファイルを USBスティックまたはネットワーク経由で読み込み、運転が開始される。最大 3つのプライマーまたはMPDミックスは、自動 で分注される。さらに手動でプライマーを添加することで、1回の運転あたりアッセイの数を増やすことができる。 SNPや変異のアッセイのスループットが向上 マルチプライマーディスペンセーション（MPD）は、カート バーで 4倍以上、1ランで 12以上のシークエンスプライマー リッジのリサーバーで処理できる以上の数のアッセイを処理 を全自動の解析ワークフローに組み込むことがでます（図 3）。 する場合に有用な機能です。MPDを用いれば、1つのリザー Loading Dispensing Annealing 図 3. マルチプライマーディスペンセーション（MPD）の原理 シークエンスプライマーを混合してプライマーカートリッジの 1つのリザーバーに 入れ、4つの異なるウェルに分注する。各プライマーはそれぞれターゲット配列に のみ特異的にアニーリングし、パイロシークエンスの伸長反応が起こる。ただMPD Pyrosequencing で混合するプライマーは、互いに結合したり、他の配列に結合したりしないよう 設計しなければいけない。 well 1 well 2 well 3 well 4 信頼あるロングリードシークエンスのためのアドバンスドテクノロジーとソフトウェア PyroMark Q48 Autoprepの特長として、ケミストリーと装置 に減光され、結果としてアッセイのリード長を制限していま の解析アルゴリズムの改善があげられます。これらはアッセ した。この問題を解決するため、PyroMark“ Advanced”ケミス イのリード長、塩基の読み取り精度および変異やメチル化の トリーと解析アルゴリズムが新たに開発され、バックグラウ 定量結果において、PyroMark Q96や PyroMark Q24 systems ンドの低減に成功し、結果としてリード長の伸長と読み取り と比べて飛躍的改善を行ないました。これまでのシステムでは データの信頼性向上につながりました。解析するシークエン バックグラウンドシグナルによって、検出シグナルが相対的 スによっては、140塩基以上のリード長を実現しました。 2 PyroMark Q48 Autoprep 10/2015

PyroMarkのモデル間におけるアッセイ互換性 これまで設計したパイロシークエンシングアッセイと が得られたことから、そのアッセイ互換性はモデル間で高い PyroMark Q48 Autoprepおよび Advancedケミストリーとの ことが示されました（図 4）。さらにシークエンスプライマー 間には、強い互換性があります。各 PyroMark装置のシリーズ から解析したい塩基までの距離は、モデル間で差異はありま 間で、既知のミューテーション頻度とメチル化比率をもつサ せんでした。単一シークエンスでの複数個所の多型や DNA ンプルを使用して比較を行なったところ、ほぼ同等のデータ メチル化解析をする場合、特に重要となる特長です。 A NRAS mutation B ER-alpha methylation Measured frequency (%) Measured methylation (%) 100 100 75 75 50 50 25 25 0 0 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 Mutated plasmid (%) Methylated control DNA (%) PyroMark Q48 Autoprep PyroMark Q24 PyroMark Q48 Autoprep PyroMark Q24 PyroMark Q24 Advanced PyroMark Q24 Advanced PyroMark Q96 ID 図 4. PyroMarkのモデル間におけるアッセイ互換性 A NRASのアッセイで、野生型と変異型を既知の濃度で混合したサンプルを使用して、頻度解析を行なった。測定された変異型の頻度を装置モデルごとにプロット すると高い相関が示された。 B ER-aのメチル化比率をメチル化および非メチル化コントロール DNAの混合物を用いて測定した。特定の CpG部位のメチル化比率 を装置モデルごとにプロットすると高い相関が示された。 磁気Aビーズによるサンプル調製を可能にした新しいディ1ス2クデ3 ザ4イン5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.77 >30 0.83 >30 0.78 >30 0.86 >30 0.76 >30 0.72 >30 PyroMark Q48 Discsは、テンプレート調製とパイロシーク たら、サンプルやラン毎に効率的に除去されるために、単一 B 0.88 >30 0.99 >30 0.83 >30 0.73 >30 0.73 >30 0.96 >30 エンスを単一の装置内で自動で処理できるように設計されま ランでの C 1.07ウ>ェ30ル0.間76ま>3た0は0.8連7 続>3す0 0る.7ラ3 >ン30の0デ.66ィ>ス30ク0.間66で>3ク0ロス した。全てのテンプレート調製に必要な試薬は反応が終わっ コンDタ0ミ.65ネ>ー30シ0.ョ57ン>の30リ0.ス63ク>3を0極0.7力2低>3減0 で0.7き9る>3設0 0計.7で4 >す30。 PCR product No template A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 AA 00..7777 >>3300 00.8.833>3>0300.07.878>3>0300.806.8>630>300.706.7>630>300.720.>7320>30 AA 00..7744 00..661100.7.79900.8.8440.07.5750.08.1810.701.701.701.701.603.603.740.70.4640.06.4860.86 BB 00..8888 >>3300 00.9.999>3>0300.08.383>3>0300.703.7>330>300.703.7>330>300.960.>9360>30 BB 00..7733 00..666600.8.82200.6.6550.06.6660.06.0600.607.607.505.505.609.609.790.709.870.08.7690.69 CC 11..0077 >>3300 00.7.766>3>0300.08.787>3>0300.703.7>330>300.606.6>630>300.660.>6360>30 CC 00..7700 00..7766 00.7.76600.6.6330.08.6860.08.9890.806.806.704.704.704.704.720.70.2800.08.0560.56 D 0..65 >>3300 00.5.577>3>0300.06.363>3>030 .702.7>230>300.709.7>930>300.740.>7340>30 D 0..85 0..6800.8.83300.8.8110.07.5750.08.2820.706.706.901.901.606.606.750.70.5790.07.9760.76 PCR product No template No template B 図 5. ウェル間およびディスク間でクロスコンタミネーションを排除 ラン A 1では、2PCR3産物と4 No 5templ6ate co7ntrol（8NTC9）を1交0互に11Pyro1M2ark Q48 Discにセットして、パイロシークエンシングを実施したところ、ウェル間のクロス コンタミネーションを示さなかった。ラン B では、最初のサンプルランからアブソーバーストリップを交換せずにNTCサンプルのみとしてランを行なった。結果 A 0.74 0.61 0.79 0.84 0.75 0.81 0.71 0.71 0.63 0.74 0.64 0.86 は、1回目のランから持ち込まれたクロスコンタミネーションは無視できる範囲であることが示された。結果は relative light unitsで示した。 B 0.73 0.66 0.82 0.65 0.66 0.60 0.67 0.55 0.69 0.79 0.87 0.69 C 0.70 0.76 0.76 0.63 0.86 0.89 0.86 0.74 0.74 0.72 0.80 0.56 D 0.85 0.68 0.83 0.81 0.75 0.82 0.76 0.91 0.66 0.75 0.79 0.76 No template PyroMark Q48 Autoprep 10/2015 3

オーダーインフォメーション 製品名 内容 Cat. no. 価格（￥） PyroMark Q48 Autoprep 装置本体およびカートリッジ一式、ソフトウェア、 9002470 7,240,000～ ピペット、設置・基本取扱説明、1年間保証 PyroMark Q48 Discs (50) PyroMark Q48 Autoprep反応用ディスク（50枚入） 974901 15,000 PyroMark Q48 Absorber Strips (100) PyroMark Q48 Autoprep廃液用消耗品（100本入） 974912 12,500 PyroMark Q48 Cartridge Set PyroMark Q48 Autoprep 3種カートリッジのセット 9024321 153,000 PyroMark Q48 Nucleotide Cartridge dNTPを添加するためのカートリッジ 9024322 56,500 PyroMark Q48 Reagent Cartridge 酵素、基質、変性バッファー、アニーリング 9024323 56,500 バッファー等のためのカートリッジ PyroMark Q48 Primer Cartridge シークエンスプライマーのためのカートリッジ 9024324 56,500 PyroMark Q48 Autoprep Starter Kit PyroMark Q48 Magnetic Beads (300)、 974230 139,500 PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)、 PyroMark Control Oligo, PyroMark Q48 Discs (50) および PyroMark Q48 Absorber Strips (100) PyroMark Q48 Advanced Reagents PyroMark Q48 Autoprep SNP／変異解析、 974002 55,000 (4 x 48) ショートリード用（192反応分） PyroMark Q48 Advanced CpG PyroMark Q48 Autoprep CpG解析、 974022 60,000 Reagents (4 x 48) ロングリード用（192反応分） PyroMark Q48 Magnetic Beads (300) 磁性セファロースビーズ標識アビジン（300反応分） 974203 13,000 PyroMark Q48 Software License (1) 追加の PyroMark Q48ソフトウェアライセンス 9024325 Inquire （1ライセンス分）。PyroMark Q48 Autoprepソフト ウェアと一緒に使用する場合のみ購入可能 PyroMark Q48 Software License (5) 追加の PyroMark Q48ソフトウェアライセンス 9024326 Inquire （5ライセンス分）。PyroMark Q48 Autoprepソフト ウェアと一緒に使用する場合のみ購入可能 記載の製品は研究用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。最新のライセンス情報および製品ごとの否認声明に関しては www.qiagen.comの“Trademarks and Disclaimers”をご覧ください。QIAGENキットの Handbookおよび User Manualは www.qiagen.comから入手可能です。 記載の価格は希望小売価格です。 PyroMark Q48 Autoprepのより詳細な情報は弊社ウェブサイト www.qiagen.com/Prod-PyroMark-Q48-Autoprepを ご覧ください。 Trademarks: QIAGEN®, PyroMark ™ , Pyrosequencing® (QIAGEN Group). 本文に記載の会社名および商品名は、各社の商標または登録商標です。© 2015 QIAGEN, all rights reserved. www.qiagen.com 株式会社 キアゲン | 〒104-0054 | 東京都中央区勝どき3-13-1 | Forefront Tower II Tel:03-6890-7300 | Fax:03-5547-0818 | E-mail:techservice-jp@qiagen.com 2302334 10/2015